针药人工周期疗法调控痰湿型多囊卵巢综合征患者MAPK/ERK途径的临床观察

2018/08/03 09:42

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许金榜1，杨娟1, 游秀密1, 张俊新1, 林秋平1, 顿晶晶1, 林莺1*(1福建省妇幼保健院，福建医科大学附属医院，福州 350001；2福建中医药大学，福州，350122)摘要：目的:探讨针药人工周期疗法改善痰湿型多囊卵巢综合征生殖内分泌紊乱的作用机制。方法：本课题采用前瞻、随机、对照临床研究设计，入选的有效病例62例，治疗组32例，施予针灸、中药及二甲双胍，对照组30例，口服二甲双胍，治疗时间均为12周。主要疗效指标包括排卵、妊娠情况、内分泌系统生化指标（FSH、LH、LH/FSH、PRL、E2、T）改善情况以及胰岛素促有丝分裂通路MAPK/ERK途径相关基因（INSR、IRS、ERK1、ERK2）转录水平及其相应蛋白表达水平及磷酸化水平。结果：治疗组治疗后排卵率为88%，妊娠率为58.6%，均显著高于对照组的排卵率（73.3%）和妊娠率（26.1%）（ P<0.05），治疗组及对照组治疗后LH、LH/FSH、T、P-ERK1、ERK1磷酸化比例等较治疗前有明显下降（ P<0.05）。治疗组LH、LH/FSH、T、P-ERK1、ERK1磷酸化比例等差值显著高于对照组（P<0.05）。结论：针药人工周期疗法能有效改善多囊卵巢综合征患者生殖内分泌紊乱，疗效确切，值得推广应用。关键词：多囊卵巢综合征；生殖内分泌；信号通路；中医药疗法；人工周期Clinical study on the regulation of MAPK/ERK pathway with acupuncture and traditional Chinese medicine artificial cycle in polycystic ovary syndrome with phlegm dampness XU Jinbang1, YANG Juan1, YOU Xiumi1, ZHANG Junxin1, LIN Qiuping1, DUN Jingjing1, LIN Ying2*(1 Fujian provincial maternity and children hospital, affiliated hospital of Fujian medical university, Fuzhou, 350001; 2 Fujian university of traditional Chinese medicine)Abstract：Objective：To explore the mechanisms of acupuncture and traditional Chinese medicine (TCM) artificial cycle therapy improving reproductive endocrinologic disorders of polycystic ovary syndrome (PCOS) with phlegm dampness.Methods：This study used a prospective randomized controlled clinical trial. 62 PCOS outpatients with phlegm dampness were enrolled，which were randomly divided into two groups: treatment group and control group. The treatment group was treated with acupuncture, traditional Chinese medicine and metformin,while the control group was treated with metformin. The two groups were treated for a period of 12 weeks. The main outcome measures including ovulation and pregnancy rate,sex hormone index （FSH、LH、LH/FSH、PRL、E2、T）, expression levels of related target genes(INSR,IRS,ERK1,ERK2) and expression levels and phosphorylation levels of their corresponding proteins of insulin signaling pathway.Results: The ovulation rate of the treatment group was 88% and the pregnancy rate was 58.6%, which was significantly higher than those of the control group (73.3% and 26.1%,respectively) (P<0.05), The comparison within groups showed that LH,LH/FSH,T,P-ERK1 and ERK1 phosphorylation ratio of the treatment group and control group were all significantly decended after treatment (P<0.05). The comparison between groups showed that the differences of LH,LH/FSH,T,P-ERK1 and ERK1 phosphorylation ratio were significantly higher than those of control group (P<0.05).Conclusion: Acupuncture and TCM artificial cycle therapy can effectively improve the reproductive endocrinology of PCOS patients and is worthy of popularization and application.Key words: polycystic ovary syndrome, reproductive endocrinologiy, signaling pathway, traditional Chinese medicine therapy, artificial cycle      多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是目前临床最常见的妇科内分泌疾病，患病率可达4％～20％，其症状具有明显的异质性，包括月经不规则、无排卵性不孕、多毛和高雄激素血症以及代谢异常和胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)等，是WHO 2型无排卵性不孕症的首要病因[1, 2]。研究表明：PCOS患者丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（mitogen activated protein kinase/extracellular signal regulated kinase，MAPK/ERK）信号转导通路功能异常与PCOS发生发展密切相关，该通路参与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的合成，卵巢黄素化颗粒细胞可以在胰岛素的促进下合成VEGF，PCOS患者比非PCOS患者的颗粒细胞会合成更多的VEGF，这可能是由于PCOS患者高胰岛素状态激活MAPK/ERK信号转导通路，异常活化MAPK/ERK途径的信号转导，放大其对细胞的生长和分化作用[3]。MAPK/ERK通路可通过丝氨酸磷酸化近端代谢信号分子如IRS-1产生代谢通路的胰岛素抵抗[4]。PCOS卵巢颗粒细胞IRS1增多，通过MAPK/ERK信号转导通路促进颗粒细胞大量增殖，与卵巢增大有关[5]。       针药人工周期治疗本病的优势在于，通过中医辨证论治，整体调理，可以改善PCOS患者的生殖内分泌紊乱及胰岛素抵抗,从而达到减肥、调经和养卵促排助孕的目的。本研究拟通过观察患者排卵、妊娠情况、内分泌系统生化指标改善情况以及胰岛素促有丝分裂通路MAPK/ERK途径相关基因转录水平及蛋白表达和磷酸化水平的变化情况，综合评估针药人工周期疗法治疗肥胖型PCOS的临床疗效，并初步探讨其改善PCOS生殖内分泌紊乱的作用途径。1　资料与方法1.1 诊断标准       1.1.1 西医诊断：符合2003年欧洲人类生殖和胚胎与美国生殖医学学会的鹿特丹专家会议推荐的PCOS诊断标准[6]： 1）稀发排卵或无排卵；2）高雄激素的临床表现和（或）高雄激素血症；3）超声表现为多囊卵巢（一侧或双侧卵巢有 12 个以上直径为 2~9 mm 的卵泡，和（或）卵巢体积大于10 ml）；上述 3 条中符合 2 条。     胰岛素抵抗诊断标准[7]：用HOMA模型评价胰岛素抵抗。HOMA稳态模型胰岛素抵抗指数（HOMA－IR）=（空腹血糖（mmol/L）×空腹胰岛素（mIU/L）/22.5；HOMA-IR的切割点根据年龄匹配的背景调查人群该指数的上25%位点1.66确定，≥1.66为胰岛素抵抗；＜1.66为非胰岛素抵抗。       超重诊断标准：符合中华人民共和国卫生部疾病控制司编写的《中国成人超重和肥胖症预防控制指南（试行）》[8]中国成人超重标准。体重指数（BMI）=体重（kg）/身高2（m2）≥23。或者腰围>80cm。       1.1.2 中医诊断: 符合《中药新药治疗月经不调的临床研究指导原则》[9]及《中医妇科学》第7版教材[10]有关痰湿型月经不调的中医诊断标准：①主证:月经后期，稀发,经色淡红,质粘腻,甚则停闭；②次证:胸腹痞满，口腻痰多,形体肥胖,神疲嗜睡,头晕目眩,大便溏泄,易恶心呕吐,面目虚浮或恍白,舌淡胖或胖嫩或有齿印,苔白腻,脉滑；具备主症之一项,次症二项或以上,加舌脉可诊断。       1.2 纳入标准： ①符合西医及中医诊断标准的患者;②有胰岛素抵抗者;③32.5>BMI≥23，或者腰围>80cm。④年龄在20-40岁之间;⑤自愿受试并可定期复诊者       1.3 排除标准：①排除其他原因的高雄激素血症者，如迟发型先天性肾上腺皮质增生、库欣综合征、分泌雄激素的肿瘤等，以及其他引起排卵障碍的疾病者，如高泌乳素血症、卵巢早衰、垂体或下丘脑性闭经等。②排除器质性疾病或其他内分泌疾病；③合并有肝肾、脑血管、心血管和造血障碍等原发性疾病,精神病患者；④近3月内服用过激素类药物如避孕药、糖皮质激素者,或参加其他临床实验的患者；⑤不符合纳入标准或资料不全等影响判断者；⑥不能坚持疗程，中途退出或失访者；⑦试验中，出现严重并发症者。       1.4 一般资料选用2014年12月至2016年12月就诊于福建省妇幼保健院妇科及中医科门诊中医辨证为痰湿型的PCOS并发IR的患者70例，运用SPSS统计软件按照治疗组：对照组=1:1的随机分组，设定生成随机数字。将患者随机分为治疗组35例，对照组35例。治疗组年龄21～34岁，平均（27.094±3.266）岁，病程3～156个月，平均（57.188±42.337）月，身高147～172cm，平均（159.719±5.413）cm，体重54～92kg，平均（65.703±8.223）kg，BMI22.04～33.60，平均（25.738±2.718），腰围72～192cm，平均（86.844±8.409）cm。对照组年龄20～32岁，平均（26.033±2.871）岁，病程4～132月，平均（42.333±29.921）月，身高153～168cm，平均（160.167±3.687）cm，体重56～80kg，平均（65.750±7.583）kg，BMI22.04～32.05，平均（25.629±2.838），腰围76～95cm，平均（84.020±4.887）cm。两组患者在年龄、病程、身高、体重、体重指数(BMI)、腰围等方面比较，差异无统计学意义（P>0.05），两组具有可比性。本研究已通过福建省妇幼保健院伦理委员会批准[伦理审批号：(2013)伦研审批第（008）号]。     1.5 治疗方法对照组：口服二甲双胍（格华止，中美上海施贵宝制药有限公司，国药准字H20023370）：一次一片（500mg），一天3次，连续3个月。治疗组：口服二甲双胍同对照组，中药协定处方免煎颗粒剂由北京康仁堂药业有限公司负责生产。卵泡期（5-11天）：以补肾养血、健脾化痰为治则，取穴：关元、气海、子宫、卵巢、归来、大赫、三阴交；用药：菟丝子30g、紫石英30g、香附10g、鸡血藤30g、赤芍15g、陈皮15g、茯苓15g等。排卵期（12-16天）：以温阳活血，化痰通络为治则，取穴：关元、气海、子宫、卵巢、中极、五枢、血海、阴陵泉、三阴交；用药：菟丝子30g、紫石英30g、香附10g、鸡血藤30g、三棱15g、莪术15g等。黄体期（17-28天）：以补益肝肾、健脾化痰为治则，用药：菟丝子30g、续断30g、桑寄生30g、山药30g、茯苓15g、砂仁6g等。上述针灸方案皮肤常规消毒、进针,捻转提插，以得气为度。除月经期间停止治疗外，隔日1次，每次30分钟，1个月1疗程，连续治疗3个月。中药协定处方均做成免煎颗粒剂，患者口服一次一包，一天两次，连续治疗3个月。上述两组患者中有生育要求者，其中治疗组29例，对照组23例，于月经第2～6天加用来曲唑（芙瑞）：规格2.5mg*10片，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批准文号：国药准字H19991001。一次两片（5mg），一天一次，共5天。于排卵后加用地屈孕酮（达芙通）：规格10mg*20片，荷兰苏威制药有限公司生产，批准文号：进口药品注册证号：H20110211。一次一片（10mg），一天两次，共12天。1.6 观察指标1.6.1 排卵率及妊娠率       所有患者在观察周期内均每日清晨自测基础体温以监测排卵情况，其中有生育要求者于促排卵周期的第11天开始阴道B超监测卵泡和内膜情况。排卵率=排卵周期数/总观察周期数×100%；妊娠率=确诊妊娠患者数/总生育要求患者数×100%。1.6.2 性激素水平      黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、催乳素（PRL）、雌二醇（E2）、T的测定：采用德国西门子公司ADVIA Centaur XP化学发光分析仪测定,操作均严格按照实验规程进行并在血浆收集后2 h 内完成。1.6.3 MAPK/ERK通路相关基因转录水平的检测      采用real-time PCR检测法，①用超纯RNA提取试剂（TaKaRa Code D9108B）提取组织样本中总RNA：实验操作按产品说明书进行。②使用Nanodrop2000超微量分光光度计测定RNA的A260/A280的比值，理想的RNA纯度A260/A280应在1.9-2.1范围之间。③逆转录试剂盒（TaKaRa code DRRO47A）进行逆转录，将RNA模板、引物、5xRT Buffer 和RNase-freeWater溶解并置于冰上备用。向反应管中加入20ul反应体系,进行逆转录反应。④用ABI 7500型荧光定量PCR仪，胰岛素受体（INSR）上游引物：5’—CAG CAG AGA AGC ACC TAG CA—3’，下游引物：5’—CAC AGC ACA GCC ACT TGT TC—3’，扩增产物长度83bp；胰岛素受体底物（IRS）上游引物：5’—ACA GGT TTG CAG GAC TCG AC—3’，下游引物：5’—AAC TCC TGA GAA GCG CTG TG—3’，扩增产物长度141bp；ERK1上游引物：5’—TGA GCA ACA AGC TGA AGT CC—3’，下游引物：5’—AGG CAC CTC CAG TCA CAC AA—3’扩增产物长度146bp；ERK2上游引物：5’—TGA TTG CTG ACT ACA GCC AC—3’，下游引物：5’—AGG CTC CTC TGG TCC ATC AA—3’，扩增产物长度95bp；扩增程序为：95°30秒，（95℃ 5sec，60℃ 34sec），40个循环。将各样品cDNA 10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增⑤计算出各样品的目的基因相对定量结果。1.6.4 MAPK/ERK通路相关蛋白表达水平及磷酸化水平的检测       采用Western blot法。取总蛋白进行SDS-PAGE电泳，经PVDF 膜转移，INSR（英国Abcam公司，货号：AB172965，抗体稀释度为1:1000）、P-INSR（英国Abcam公司，货号：AB60946，抗体稀释度为1:1000）、IRS（英国Abcam公司，货号：AB52167，抗体稀释度为1:800）、P-IRS （英国Abcam公司，货号：AB66153，抗体稀释度为1:1000）、ERK1（英国Abcam公司，货号：AB2537，抗体稀释度为1:600）、P-ERK1（英国Abcam公司，货号：AB194770，抗体稀释度为1:800）、ERK2（英国Abcam公司，货号：AB32081，抗体稀释度为1:800）以及P-ERK2（英国Abcam公司，货号：AB47339，抗体稀释度为1:1500）等一抗4℃ 孵育过夜，再与HＲP偶联二抗( 1∶3000)室温孵育1.5 小时，ECL 化学发光剂显影，压片检测。采用Image J 测定各蛋白的相对光密度值，以目的条带和内参β-actin 条带的灰度比值分别表示各蛋白的表达水平。       1.7 统计学方法  所有资料采用SPSS17.0软件包进行统计分析。根据临床试验数据性质(计量、分类资料和等级资料),采用描述性分析,计算X土S,M(P75-P25),构成比及率等,选择合适的统计分析方法。组内比较用配对t检验,若非正态性或方差不齐,用秩和检验;组间比较,分类资料用卡方检验,计量资料用独立样本t检验,若非正态性或方差不齐,用秩和检验,检验水平α=0.05。2　结果       2.1 病例完成情况  治疗组脱落3例，其中1例受试者无法耐受不良反应，不愿继续进行临床试验而退出；2例受试者为外地患者，交通不便，退出临床试验。对照组脱落5例，其中3例受试者无法耐受不良反应，不愿继续进行临床试验而退出；1例受试者为外地患者，交通不便，退出临床试验；1例受试者长期出差，未按时服药，未纳入最终研究。因此共纳入完整观察病例62例，其中治疗组32例，对照组30例。治疗组合并不孕症29例，对照组合并不孕症23例。       因为正常妊娠后雌孕激素水平显著升高，负反馈抑制下丘脑及垂体功能，导致LH、FSH等水平显著降低；正常妊娠后胰岛素敏感性较妊娠前下降50～60%，出现生理性胰岛素抵抗，导致胰岛素分泌增加，空腹血浆胰岛素升高[11]，上述妊娠生理变化将显著影响治疗后内分泌代谢及胰岛素抵抗指标的评估，故治疗组17例妊娠患者，对照组6例妊娠患者治疗后均未测定性激素水平、胰岛素信号通路相关基因转录水平、蛋白表达水平及磷酸化水平。2.2 两组患者治疗后排卵及妊娠情况比较       对两组患者治疗后排卵及妊娠情况进行组间比较，发现治疗组排卵率及妊娠率均显著高于对照组，认为治疗组能更好地改善患者排卵障碍，提高妊娠率，经卡方检验，差异有统计学意义（P<0.05），详见表1。<img src="/Public/uploads/image/20180803/1533260467341558.png" title="1533260467341558.png" alt="QQ截图20180803093924.png"/>2.3 两组患者治疗后性激素水平比较（表2）两组患者治疗后性激素水平进行组内比较，发现在治疗后两组患者LH、LH/FSH、T等水平均较治疗前有明显下降（P<0.05）；对两组患者治疗后性激素水平差值进行组间比较，发现治疗组LH、LH/FSH、T等差值显著高于对照组（P<0.05）。<img src="/Public/uploads/image/20180803/1533260482429273.png" title="1533260482429273.png" alt="QQ截图20180803093937.png"/>2.4 两组患者治疗后MAPK/ERK通路相关基因转录水平比较（表3）       对两组患者治疗后MAPK/ERK通路相关基因转录水平进行比较，未发现INSR、IRS、ERK1、ERK2等基因转录水平发生显著变化（P>0.05）。<img src="/Public/uploads/image/20180803/1533260500516263.png" title="1533260500516263.png" alt="QQ截图20180803093951.png"/>2.5 两组患者治疗后MAPK/ERK通路相关蛋白表达水平及磷酸化水平比较（表4，图1）       对两组患者治疗后MAPK/ERK通路相关蛋白表达水平及磷酸化水平进行比较，发现在治疗后两组患者P-ERK1、ERK1磷酸化比例等均较治疗前显著下降（P<0.05）；对两组患者治疗后相关蛋白表达水平及磷酸化水平差值进行组间比较，发现治疗组P-ERK1、ERK1磷酸化比例差值显著高于对照组（P<0.05）。 <img src="/Public/uploads/image/20180803/1533260521446070.png" title="1533260521446070.png" alt="QQ截图20180803094003.png"/>3　讨论       针药人工周期疗法是基于中医妇科学理论，并结合西医卵巢周期性改变而提出的，在辨证论治的基础上，根据月经周期中阴阳气血消长变化规律，在不同月经阶段分期用药，调理脏腑阴阳气血以调节月经的一种治疗方法。《傅青主女科》云: “经水出诸肾。”肾藏精，主生殖，为先天之本，人体的生殖功能与肾的气化密切相关。妇女的一生尤其是生殖功能的盛衰与“肾气的盈虚、天癸的至竭”紧密相关。天癸的化生有赖于肾中精气充盛。中医学认为，妇女的生殖功能轴是肾-天癸-冲任-胞宫轴，而PCOS的发病主要是因为肾-天癸-冲任-胞宫轴失调，卵巢功能障碍导致排卵功能发生异常，闭锁卵泡滞留于卵巢皮质内不能排出，使卵巢呈现多囊样改变的一种疾病。我们认为，PCOS月经失调和不孕症治疗的关键节点就是促排卵，只有卵泡发育正常了，月经才能“如期而至”；有了卵子，才有受精成孕的物质基础。因此针药人工周期正是根据月经周期中不同阶段肾气的盈虚，以补肾为根本，配合周期性用药，积极促进卵泡发育，以达到调经助孕之目的。主要分为三个阶段进行用药取穴。卵泡期以补肾气养冲任为主，促进卵泡发育；排卵期以温阳活血通络为主，使已成熟之卵子突破卵巢表面而排出；黄体期以补益肝肾、健脾化痰为主，促进黄体功能健全及受精卵着床。       本研究结果显示治疗组在治疗后LH、LH/FSH、T等性激素水平较治疗前有明显下降，且LH、LH/FSH、T等下降幅度也显著高于对照组，因此针药人工周期疗法较单纯二甲双胍治疗能更有效地调节患者的生殖内分泌紊乱。这与吴薇[12]、潘文等[13] 、朱宝申等[14]、谢桂珍等[15]研究一致。治疗组在治疗后排卵率为88%，妊娠率为58.6%，均显著高于对照组的排卵率（73.3%）和妊娠率（26.1%），因此针药人工周期疗法较单纯二甲双胍治疗能更好地改善患者排卵功能障碍，从而提高妊娠率。其机制可能与针药人工周期疗法改善了患者的生殖内分泌及代谢紊乱，卵巢卵泡局部雄激素水平及IR状态得到一定程度的缓解，卵子发育的微环境得到改善，卵子的质量得到提升有关。      治疗组在治疗后P-ERK1、ERK1磷酸化比例等较治疗前显著下降；且P-ERK1、ERK1磷酸化比例等变化幅度均显著高于对照组，表明针药人工周期疗法比单纯二甲双胍治疗更能有效地调控患者的胰岛素信号通路相关蛋白表达水平及磷酸化水平，能显著抑制MAPK/ERK信号通路的促有丝分裂活性，这与Tosca等[16]人的研究一致。       综上所述，我们认为，PCOS治疗应当中西结合，综合治疗，多种手段，各取所长。因此针药人工周期疗法能显著改善痰湿型PCOS患者的性激素水平、排卵率及妊娠率，从而显著改善PCOS患者的生殖内分泌紊乱，其机制可能与调控MAPK/ERK信号通路的促有丝分裂活性有关。参考文献[1] Obermayer-Pietsch B, Trummer C, Schwetz V, et al. 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