检测血清mir-29表达观察针药人工周期疗法对痰湿型多囊卵巢综合征胰岛素抵抗的临床疗效

2018/07/16 15:15

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杨娟，刘英，黄健，许金榜，游秀密，林秋平，张俊新，顿晶晶，黄山（福建医科大学附属福建省妇幼保健院中医科，福建福州 350001）摘要：目的：探讨在西药基础上针灸联合中药人工周期疗法与单纯西药治疗对痰湿型多囊卵巢综合征（PCOS）胰岛素抵抗患者的临床疗效差异，并探讨其部分作用机制。方法：将60例患者随机分为观察组和对照组，每组30例。对照组于月经第3 d开始口服来曲唑和二甲双胍。观察组在对照组基础上予以针灸配合中药治疗。主穴取关元、气海及双侧子宫、卵巢、丰隆、阴陵泉、足三里、三阴交，卵泡期配合大赫穴，并于关元和气海穴行温针灸；排卵期配合中极、血海穴，并于气海和中极穴、血海和阴陵泉穴接2组电针，选择2 Hz连续波；黄体期取以上主穴，并艾灸关元和气海穴；月经期间停止治疗，隔日1次，每次30 min。中药以补肾养血、健脾化痰为主。两组均连续治疗3个月经周期。1、比较两组患者中医症状积分变化；2、测定患者促卵泡激素(follicle stimulating hormone，FSH)、促黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、睾酮(testosterone,T)、LH/FSH值、胰岛素抵抗指数观察痰湿型多囊卵巢综合征患者内分泌代谢的变化情况；3、比较两组患者的妊娠率；4、检测患者血清中miR-29表达水平。结果：两组治疗后中医症状积分均低于治疗前（P<0.01，P<0.05），且观察组积分低于对照组（P<0.05）,两组间治疗前后差值比较，观察组降低程度显著高于对照组（P<0.01）。两组内分泌指标治疗前后，观察组LH、T治疗前后比较（P<0.05），LH/FSH治疗前后比值(P<0.01)，差异有显著意义，FSH治疗前后比较（P>0.05），对照组治疗前后FSH、LH、LH/FSH（P>0.05），未见明显改善，T治疗前后P<0.05，差异有统计学意义，两组治疗后比较LH/FSH、T的改善情况观察组优于对照组,P<0.05,差异有统计学意义，两组间治疗前后差值比较，LH、LH/FSH低于对照组（P<0.05）；两组治疗前后血糖，P<0.05，差异有统计学意义，胰岛素和IR指数P<0.01，差异有显著意义；观察组血糖、胰岛素和IR指数改善情况优于对照组（P<0.05），治疗前后组间差值比较，INS、HOMA-IR，差异有统计学意义（P<0.05），血糖差异无统计学意义，P>0.05；观察组妊娠率为56.7%（17/30），明显高于对照组的30.0%（9/30，P<0.05）。两组血清中mir-29表达治疗后低于治疗前（P<0.05），治疗后比较观察组疗效优于对照组（P<0.05），两组间治疗前后差值比较，观察组明显低于对照组（P<0.01）。结论：针药人工周期疗法能改善痰湿型多囊卵巢综合征患者的内分泌和胰岛素抵抗情况，同时能显著提高患者的妊娠率，从分子生物学角度，有可能通过mir-29表达的改变来作用于多囊卵巢综合征胰岛素抵抗患者。关键词：多囊卵巢综合征，痰湿型；胰岛素抵抗；针灸；中药；随机对照试验        多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是育龄妇女常见的内分泌紊乱性疾病，据统计，鹿特丹标准执行开始，已有超10%的育龄妇女患有PCOS[1]。Paolo Moghetti[2]为诠释胰岛素抵抗对于PCOS患者的意义，分别从流行病学、发病机制、病理生理学和治疗等方面总结，约有70%的女性存在胰岛素抵抗,胰岛素抵抗和高雄激素血症是PCOS的重要特征。PCOS患者常表现为月经稀发或闭经，肥胖，多毛，面部痤疮等，《女科切要》云：“肥人经闭必是痰湿与脂膜壅塞之故。”中医学从“肥人多痰”理论来阐释PCOS核心病理机制，中医治疗本病的优势在于，通过针灸、中药的方式，辨证论治，整体调理，帮助患者重新建立一个更为规律的月经周期,从而达到减肥、调经和养卵促排助孕的目的，但是中医治疗和改善PCOS胰岛素抵抗的具体机制仍有待于进一步深入探讨，这也是目前国内外研究的一个热点和重要方向。因而本研究探讨在西药基础上针灸联合中药人工周期疗法对痰湿型PCOS胰岛素抵抗的临床疗效，并与单纯西药治疗对照，观察患者血清微小核糖核酸-29（microRNA-29，mir-29）表达的变化，分析其与PCOS胰岛素抵抗的相关性,从分子生物学角度，探讨针药人工周期疗法干预PCOS胰岛素抵抗的作用机制。现报告如下。1  临床资料1.1 一般资料 选择2014年9月至2016年9月本院中医科门诊的痰湿型PCOS胰岛素抵抗患者60例，按照随机数字表法分为观察组和对照组，每组30例。观察组年龄最小21岁、最大34岁，平均（28±3）岁；病程最短3个月、最长156个月，平均（71±51）个月；体质量指数最低18、最高33，平均（24±4）。对照组年龄最小20岁、最大33岁，平均（26±4）岁；病程最短3个月、最长156个月，平均（50±45）个月；体质量指数最低18、最高31，平均（26±4）。两组患者在年龄、病程、体质量指数一般资料比较差异无统计学意义（均P>0.05）,具有可比性。1.2诊断标准1.2.1西医诊断标准：参照2003年欧洲人类生殖和胚胎与美国生殖医学学会的鹿特丹专家会议推荐的PCOS诊断标准[3]：①稀发排卵或无排卵；②高雄激素的临床表现和（或）高雄激素血症；③超声表现为多囊卵巢（一侧或双侧卵巢有12个以上直径为2~9 mm的卵泡，和（或）卵巢体积大于10 mL）；上述3条中符合2条。④其他原因的高雄激素血症者，如迟发型先天性肾上腺皮质增生、库欣综合征、分泌雄激素的肿瘤等，以及其他引起排卵障碍的疾病者，如高泌乳素血症、卵巢早衰、垂体或下丘脑性闭经等。胰岛素抵抗诊断标准[4]：用稳态模型评价（homeostasis model assessment，HOMA）胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）。稳态模型胰岛素抵抗（HOMA-IR）指数=[空腹血糖（mmol/L）×空腹胰岛素（[请在首次出现时写出英文全称和简写。]mIU/L）]÷22.5；胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-IR）指数的切割点根据年龄匹配的背景调查人群该指数的上25%位点1.66确定，≥1.66为胰岛素抵抗；＜1.66为非胰岛素抵抗。1.2.2中医诊断标准：采用《中药新药临床研究指导原则》[请检查一下和参考文献是否一致。][5]及《中医妇科学》[6]第7版教材有关痰湿型月经不调的中医诊断标准：主证：月经后期，稀发,经色淡红,质粘腻,甚则停闭；次证:胸腹痞满，口腻痰多,形体肥胖,神疲嗜睡,头晕目眩,大便溏泄,易恶心呕吐,面目虚浮或恍白,舌淡胖或胖嫩或有齿印、苔白腻,脉滑。具备主症之一项,次症两项或以上,加舌脉可诊断为痰湿型。1.3 纳入标准①符合上述诊断标准者；②年龄在20~40岁之间者；③自愿受试并可定期复诊者；④男方精液检查正常者。⑤签署知情同意书者。1.4 排除标准①器质性疾病或其他内分泌疾病者；②合并有肝肾、脑血管、心血管和造血障碍等原发性疾病,精神病者；③近3月内服用过激素类药物如避孕药、促排卵药、糖皮质激素者,或参加其他临床试验者；④不能坚持疗程，中途退出或失访者；2  治疗方法2.1 对照组采用基础治疗方案：月经第3天开始口服来曲唑(芙瑞，江苏恒瑞医药有限公司，国药准字H19991001，2.5 mg/片)，2.5 mg/天，连续口服5 d；口服二甲双胍（格华止，中美上海施贵宝制药有限公司，国药准字H20023370，500 mg/片），每次500 mg，毎天3次，连续治疗3个月经周期。2.2 观察组      观察组[请补充从何时开始治疗。]在基础方案上[和上述基础方案一样吗？请说明。]（同上）加用针灸和中药治疗,针灸治疗从月经干净之日起开始；中药于月经第三日开始服用。2.2.1 针灸治疗      取穴：主穴：关元、气海及双侧子宫、卵巢(肚脐直下3寸，前正中线旁开3.5寸，左右各一)、丰隆、阴陵泉、足三里、三阴交。采用30 mm×40 mm毫针直刺15~40 mm，针感以患者感觉酸麻胀为度。卵泡期配合大赫穴，并于关元和气海穴行温针灸，采用五年陈艾，每个穴位艾柱直径18mm，长度约20 mm。排卵期配合中极、血海穴，并于气海和中极穴、血海和阴陵泉穴接2组电针，选择2 Hz连续波，强度调至以病人最大能耐受程度为度。黄体期取以上主穴，用两孔艾灸盒灸关元和气海穴（每个穴位艾柱规格同上）[如何和上述艾炷规格材质一致，请说明“采用上述艾炷即可”。]。月经期间停止治疗，隔日1次，每次30 min，1个月经周期为一疗程，连续治疗3个月经周期。2.2.2 中药治疗      以补肾养血、健脾化痰为主：菟丝子15 g、枸杞子15 g、覆盆子15 g、紫河车6 g、熟地黄15 g、生地黄15 g、香附10 g、当归10 g、党参15 g、茯苓30 g、薏苡仁15 g、胆南星10 g。每日1剂，煎服，1个月经周期为一疗程，连续治疗3个月经周期。3  疗效观察       治疗期间，患者分别于月经第11 d起B超动态观察卵泡发育情况，以卵泡直径≥18 mm界定为卵泡发育成熟，注射HCG（丰原HCG，马鞍山丰原制药有限公司，国药准字H34023587，2000 U/支）10000 U促进卵泡排出，卵泡成熟时指导同房。治疗3个月经周期后，比较相关指标的变化，并最终统计受孕例数，比较两组妊娠情况，具体如下：3.1 观察指标[所有条目里的观察指标都请写出观察时间。]3.1.1 中医症状评分：于治疗前后参照国家中医药管理局医政司《24个专业104个病种中医诊疗方案（试行）[7]制定的评分标准观察两组患者中医症状评分。3.1.2 内分泌激素值：于月经第3天抽血采用酶联接免疫吸附法测定(ELISA)法进行促卵泡激素（FSH）、促黄体生成素（LH）、催乳素（PRL）、睾酮（T）。[请把有英文缩写的部分写出英语全称。请检查一下和治疗结果里的指标是否一致。]3.1.3 胰岛素（INS）和血糖含量及胰岛素抵抗（HOMA-IR）指数：采用ELISA法测定空腹INS含量。采用葡萄糖氧化酶法测定血糖含量,在全自动生化分析仪上进行检测。计算HOMA-IR指数。3.1.4 两组妊娠情况比较；[请补充内容，不能只写标题不写内容。]记录两组治疗后妊娠的例数，并比较两组妊娠率。3.1.5miR-29基因转录水平的检测：采用荧光实时定量（quantitative real-time ，PCR）检测技术，用 SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa code DRR420A)进行扩增，扩增程序为：（95°30秒，95℃ 5秒，60℃ 34秒）×40个循环，Taqman探针，在荧光实时定量PCR仪上进行检测，根据解链温度（melting temperature，Tm）值和熔解峰的形状确认患者血清miR-29的转录水平。主要实验试剂：超纯RNA提取试剂（厂家及货号：TaKaRa Code D9108B），反转录试剂盒（厂家及货号：TaKaRa code DRRO47A），Real-time PCR 试剂盒（厂家及货号：TaKaRa code DRR420A），5x RNA Loading Buffer （厂家及货号：TaKaRa code DRR420A）。引物名称：Rno-mir-29-F，引物序列(5'to3')：TACTGCCGGAGTCTGACTG；Rno-mir-29-R，引物序列(5'to3')：CTCCAGGAATAGTAACCAGG。3.2统计学处理       采用SPSS 18.0，计量资料均以均数±标准差（）表示，若满足参数检验法的条件，组内采用配对t检验，组间采用独立样本的t检验；若不满足参数检验法的条件，则采用秩和检验；计数资料以频数表示，采用卡方检验，等级资料采用秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。3.3治疗结果[请补充各指标治疗前后差值的组间比较。]3.3.1两组患者治疗前后中医症状积分比较       两组患者治疗前中医症状积分比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。两组治疗后中医症状积分均低于治疗前，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05），且观察组积分低于对照组（P<0.05）。两组治疗前后中医症状积分差值比较，观察组疗效优于对照组，（P<0.01）见表1。                                        表1  两组PCOS胰岛素抵抗患者治疗前后中医症状积分比较  （分，）<img src="/Public/uploads/image/20180716/1531725083151044.png" title="1531725083151044.png" alt="QQ截图20180716150957.png"/>3.3.3两组患者治疗前后INS、血糖及HOMA-IR比较       两组患者治疗前INS、血糖及HOMA-IR值比较差异均无统计学意义（均P>0.05），具有可比性。两组治疗后INS、HOMA-IR均低于治疗前，差异均有显著意义（均P<0.01）[和表中不一致。]，血糖低于治疗前，差异有统计学意义（P<0.05），治疗后血糖、胰岛素和HOMA-IR，[？]与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。治疗前后组间差值比较，INS、HOMA-IR，差异有统计学意义（P<0.05），血糖差异无统计学意义，P>0.05。见表3。                                表3 [请列出每组例数。]两组PCOS胰岛素抵抗患者治疗前后INS、血糖及HOMA-IR比较<img src="/Public/uploads/image/20180716/1531725212336953.png" title="1531725212336953.png" alt="QQ截图20180716151223.png"/><img src="/Public/uploads/image/20180716/1531725276973800.png" title="1531725276973800.png" alt="QQ截图20180716151319.png"/>4  讨论       多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)的主要临床和生化特征是生殖功能障碍、胰岛素抵抗和高雄激素血症等，高胰岛素血症可能破坏卵巢功能，抑制排卵，从而也会影响体内的糖代谢和脂类代谢[8]。中西医结合治疗多囊卵巢综合征疗效显著，可以充分发挥中西药优势，取长补短，提高PCOS排卵率，降低西医治疗的毒副作用[补充文献][9]。近年来的研究[10]表明，中医药可以提高PCOS的排卵率和妊娠率，减低卵巢过度刺激的风险。PCOS在中医证属“月经后期”“闭经”“崩漏”“不孕”“症瘕及妊娠”等范畴，本研究根据月经周期的特点，通过针药人工周期疗法干预，全方以补肾健脾、化痰利湿为主要原则，共同作用于痰湿型PCOS患者，调理冲任，调经助孕。        针灸治疗痰湿型PCOS主穴为关元、气海、子宫、卵巢、丰隆、阴陵泉、足三里、三阴交。关元、气海穴归属任脉，“任主胞胎”，起于胞中，具有调节月经，促进生殖的作用；子宫、卵巢穴属经外奇穴，对于调节妇科疾病有特效；足三里、丰隆归属胃经，具有健脾利湿的功效；三阴交、阴陵泉穴归属脾经，具有健脾、调补肝肾的作用。卵泡期以补肾活血、健脾化痰为主，加用大赫穴，补益肾气[温针灸有什么特殊作用？],本阶段采用温针灸关元、气海穴，温暖胞宫，补肾培元，温灸持续稳定，有促进卵泡生长的作用；排卵期健脾利湿、活血通络加中极、血海穴，本阶段卵泡已发育成熟，不宜继续用灸法，而改用电针，强刺激，加强穴位健脾利湿、活血通络的作用，促进卵泡排出；[电针有什么作用？]黄体期补肾健脾，选取以上主穴位，卵泡已排出，黄体期为胚胎着床做准备，宜刺激小，因而采用艾盒灸关元、气海穴，减轻针刺的刺激量，促进胚胎着床。[为什么艾灸？]而中药补肾活血，健脾化痰为主。以菟丝子、覆盆子、紫河车、枸杞子补益肝肾，熟地黄、当归、生地黄同用，补血活血，滋而不腻，不温不寒，党参、茯苓、薏苡仁、胆南星健脾利湿化痰，香附疏肝理气。在西药基础上配合针药人工周期疗法，（1）显著改善痰湿型多囊卵巢综合征患者的中医症状；(2)调节激素水平，特别是LH/FSH和T的降低程度，疗效明显优于单纯西药组；（3）血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数都有不同程度的改善，胰岛素和胰岛素抵抗指数降低程度优于单纯西药组；（4）妊娠率较之于对照组提高26.7%，验证了该疗法治疗痰湿型PCOS胰岛素抵抗的临床疗效。       [是否是临床报道？]实验研究表明[11]，电针大鼠后三里和丰隆穴，关元和中脘穴，可以有效降低胰岛素抵抗模型大鼠的体重，调节其血糖和空腹胰岛素水平，降低胰岛素抵抗模型大鼠的甘油三酯、总胆固醇和游离脂肪酸，缓解因胰岛素抵抗导致的脂类代谢问题，调节胰岛素抵抗模型大鼠下丘脑中胰岛素受体底物（insulin substrate-2，IRS-2）的含量，上调蛋白激酶-2微小核糖核酸的基因表达，和磷脂酰肌醇-3激酶p110、p-磷脂酰肌醇-3激酶p110的蛋白表达，从而得出电针能通过调节磷脂酰肌醇-3激酶（Phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）信号通路相关的信号分子，从而改善胰岛素抵抗。李荔等[12]通过观察针灸联合二甲双胍治疗肥胖型多囊卵巢综合征不孕症的疗效，发现针灸组、针灸联合二甲双胍组和针刺安慰联合二甲双胍组均能降低体质量指数,改善胰岛素抵抗和高雄激素血症,提高患者的卵泡排出率和妊娠率,而针灸联合二甲双胍的治疗效果更加显著。郑小敏等[13]采用苍附导痰汤加减方治疗痰湿型PCOS合并IR，对PCOS患者的生殖内分泌水平及胰岛素抵抗状态均有明显调节作用，对于优势卵泡的发育和排卵，恢复正常月经周期具有促进作用，其疗效与盐酸二甲双胍相当，但不良反应少。针灸和中药用来治疗胰岛素抵抗或是痰湿型多囊卵巢综合征的疗效已被广泛验证，但对于中医药作用痰湿型多囊卵巢综合征伴有胰岛素抵抗的深层机制的探讨较少，故这是本研究要解决的关键问题。       刘长征等[14]研究发现miR-29可明显抑制胰岛素刺激葡萄糖的吸收，参与胰岛素抵抗的产生，抑制其表达可能做为2型糖尿病治疗的新方法。李莹等[15]总结发现miR-29a参与卵泡的发育、卵巢内激素的合成和成熟卵巢的周期性活动等过程，另外miR-29a还和胰岛素的合成，卵巢细胞的增殖有关，参与多种病理生理过程。miRNA-29a可能通过参与调节卵母细胞的发育和颗粒细胞的黄素化过程，成为胰岛素抵抗/高胰岛素血症介导的排卵异常的部分作用机制[16]。因而，mir-29在胰岛素抵抗的产生和排卵过程都发挥了重要的作用。在本研究显示，miR-29表达在治疗后都有不同程度的下降，而观察组中mir-29下调的程度高于对照组，因而miR-29表达的变化，为我们研究探讨针药人工周期疗法治疗多囊卵巢综合征胰岛素抵抗的机制提供了思路。[该结论是否合适，请斟酌。]       在西药基础上针药人工周期疗法治疗多囊卵巢综合征胰岛素抵抗疗效明确，但其作用机制尚处于探讨阶段，本研究提示其机制有可能通过下调mir-29的表达，使血糖、胰岛素产生相应的变化，从而改善患者的胰岛素抵抗，提高患者的妊娠率。今后我们将扩大样本量，或争取多中心大样本的研究，来进一步验证这一结论。参考文献[1] Glintborg D, Andersen M. 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Polycystic ovary syndrome: insight into pathogenesis and a common association with insulin resistance[J].Clin Med (Lond),2016,16(3):262-266.[9] 张华,梁卓. 多囊卵巢综合征的中西医研究进展[J]. 中医临床研究,2016,(32):142-144[10] 王洪振, 刘颖华, 侯丽辉. 中医药在多囊卵巢综合征不孕症促排卵治疗中的优势[J]. 医学研究杂志, 2015, 44(4):9-11.[11] 王静芝. 针刺调控下丘脑胰岛素PI3K信号通路改善胰岛素抵抗的机制研究[D].湖北中医药大学,2014.[12] 李荔,莫蕙,文斌,等. 针灸联合二甲双胍治疗肥胖型多囊卵巢综合征不孕症的临床研究[J].中华中医药杂志,2014,29(07)：2115-2119.[13] 郑小敏，华宙佳，丁彩飞.苍附导痰汤加减方对痰湿型多囊卵巢综合征合并胰岛素抵抗患者生殖内分泌及糖代谢的影响[J].浙江中西医结合杂志，2013，23(3)：216-217.[14] 刘长征，李静静，焦涛,等.MicroRNA-29抑制胰岛素刺激的大鼠L6细胞葡萄糖吸收[J].基础医学与临床,2013,33（5）:562-566.[15] 李莹,杨晓葵.微小RNA-29a在卵巢中的调控作用[J].中国优生与遗传杂志,2013,21(08):8-10.[16] Yao N, Yang BQ, Liu Y, et al.Follicle-stimulating hormone regulation of microRNA expression on progesterone production in cultured rat granulosa cells[J].Endocrine.2010,38（2）:158-166.