腕踝针对骨癌痛大鼠脊髓5-HT3A表达的影响

2018/07/13 11:42

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张春鹏2，韩盈盈1，马莉莎12，周庆辉2（1上海中医药大学，上海 2012032；２第二军医大学中医系，上海 200433）摘要：目的：观察腕踝针和电针对骨癌痛大鼠疼痛痛行为的影响及其在脊髓背角影响5-HT3A表达的作用机制。方法：将32只SPF雌性Wistar大鼠随机分为4组：电针组（EA）、腕踝针组（WA）、癌痛组（CA）和假手术组（Sham）。电针组、腕踝针组和癌痛组左腿胫骨建立骨癌痛模型，假手术组于左腿胫骨骨髓腔内注射灭活肿瘤细胞。电针组和腕踝针组在造模后第9天开始进行实验干预。癌痛组和假手术组术后不予干预。电针组治疗，取左侧“后三里”和“跟端”穴，疏密波、2Hz、强度2、每日1次，每次30min，连续治疗6天；腕踝针组，取左侧“跟端”穴，留针从下午4点至次日8点，连续治疗6天。所用大鼠均隔日称取体重；术前一天、术后第9天、11天、13天、15天进行机械痛阈测定；采用HE染色观察各组大鼠胫骨组织学变化；采用RT-PCR检测大鼠脊髓5-HT3A mRNA表达；采用Western blot法检测脊髓5-HT3A受体蛋白表达；采用免疫组化观察5-HT3A在脊髓的表达位置。结果：体重：造模后电针组、腕踝针组和癌痛组造模后第6天开始体重下降趋势，假手术组体重呈增长趋势。在第10天和第12天，电针组、腕踝针组和癌痛组三组体重无明显差异，第14天电针组和腕踝针组与癌痛组相比出现明显差异（P＜0.01），电针组和腕踝针组大鼠体重出现回升，但是癌痛组体重未见明显抬升趋势。机械痛：手术侧基础痛无差异（P＞0.05）。第9天疼痛有明显差异（P＜0.01），假手术组优于其他三组，电针组、腕踝针组与癌痛组相比较无明显差异（P＞0.05）。第11天，腕踝针组评分优于电针组和癌痛组。第13天，腕踝针评分优于电针组和癌痛组。第15天，电针组和腕踝针组评分优于癌痛组（P＜0.01）。非手术侧在第15天腕踝针组评分优于电针组和癌痛组。RT-PCR结果：第16天，脊髓5-HT3A mRNA表达四组有差异（P＜0.01），电针组和腕踝针组与癌痛组比较均有明显差异（P＜0.05），电针组与腕踝针组差异并不明显（P＞0.05）。WB结果：第16天脊髓5-HT3A受体蛋白表达，在第16天时四组有明显差异（P＜0.01），假手术组明显低于其他三组。电针组和腕踝针组均低于癌痛组（P＜0.01）。并且可以观察到脊髓5-HT3A受体的表达，电针组和腕踝针组与假手术组相比有明显差异（P＜0.01）。免疫组化结果：第16天，观察到5-HT3A受体主要表达在感受伤害性刺激的背角浅层。对脊髓背角区域阳性面积进行统计，发现电针组、腕踝针组和癌痛组脊髓背角区域阳性率高于假手术组（P＜0.05），且电针组和腕踝针组与癌痛组相比阳性率有差异（P＜0.05）。电针组和腕踝针组比较不明显。结论：电针和腕踝针提高了骨癌痛大鼠的机械痛阈，改善模型大鼠体重状况，其机制可能与电针和腕踝针影响脊髓背角浅层区域5-HT3A的表达有关。关键词：针灸；电针；腕踝针；骨癌痛；5-HT3A       癌症引起的骨痛(Cancer Induced Bone Pain, CIBP)是恶性肿瘤发展到晚期包括骨转移等情况所引起的一种严重的并发症。据报道CIBP患者在疾病后期一直经历着中度到重度的疼痛[1]，严重影响患者的生活质量，威胁患者的生存状况。早在之前Zeng等[2]发现腕踝针可以减轻肝癌患者TACE术后疼痛。虽有临床证据，但是腕踝针止痛的机制并不明确。CIBP是一种机制独特而复杂的慢性疼痛，特点是机械触诱发痛和痛觉过敏，疼痛的信息的传递从初级传入神经元通过兴奋和抑制性信号传入更高的大脑中央区域[3]。刘希江等[4]在研究中发现脊髓背角中5-羟色胺含量的增加参与了大鼠骨癌痛的维持，靶向抑制脊髓5-羟色胺能通路可缓解骨癌痛大鼠的疼痛。在5-羟色胺家族中主要为5-羟色胺3（5-HT3）参与疼痛的传递，5-HT3A型为中枢系统中主要发挥作用的亚型。Y Liang[5]等发现电针可以减轻骨癌痛大鼠的机械痛表现，但并未有电针影响脊髓5-HT3表现的研究。腕踝针在疼痛治疗方面已有30余年，但是其止痛机制却知之甚少，在临床治疗方面腕踝针和电针有很多相似之处。本研究以Walker 256大鼠乳腺癌细胞诱导的骨癌痛模型为观察对象，观察腕踝针和电针对骨癌痛大鼠的影响。1　材料与方法1.1 实验动物与分组      SPF级健康雌性Wistar大鼠40只体重140g~160g和3只体重70g（用于腹水传代），购自上海斯莱克实验动物有限公司[动物许可证编号：SCXK（沪）13-0016]。长海医院中心实验室动物饲养中心饲养，饲养期间给予啮齿动物标准颗粒饲料和饮水，12h循环灯光，恒温20~24°C，恒湿50%~70%，自由摄食和摄水，所有动物购入后均适应性饲养后进行实验。将实验大鼠随机数字法分为电针组（8只）、腕踝针组（8只）、骨癌痛组（８只）、假手术组（8只）。所有实验大鼠处置均符合科技部２００６年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。1.2 试剂与仪器       大鼠乳腺癌腹水瘤细胞Walker 256来源于上海生物医学工程研究所（本实验所用腹水细胞为复旦大学中西医结合系王彦青教授赠予）。微量注射器。氯化钠（国药集团，20151123），氯化钾（国药集团，20120328），磷酸二氢钾（国药集团，20120320），十二水合磷酸二氢钠（国药集团，20141119），多聚甲醛（国药集团，20160428），蔗糖（国药集团，20160118），氢氧化钠（国药集团，20100330），戊巴比妥钠（国药集团，20140619），Trizol（美国Invitrogen公司，1596-026），SYBR Green PCR试剂盒（美国Thermo公司，#K0223），逆转录试剂盒（美国Fermentas公司，#K1622），异丙醇（国药集团，80109218），无水乙醇（国药集团，100092680），氯仿（国药集团，10023419），RIPA组织细胞快速裂解液（北京Solarbio公司，R0010），BCA蛋白定量试剂盒（美国Thermo公司，PICPI23223），30%丙烯酰胺（29：1）（上海基尔顿生物有限公司，BYL40857），1.0M Tris-HCl,pH=8.8电泳缓冲液（上海基尔顿生物有限公司，BYL40910），1.0M Tris-HCl,pH=6.8电泳缓冲液（上海基尔顿生物有限公司，BYL40908），10% SDS（上海基尔顿生物有限公司，BYL40944），10% 过硫酸铵（上海基尔顿生物有限公司，BYL40856），TEMED（上海基尔顿生物有限公司，BYL40728），4*蛋白上样缓冲液（上海基尔顿生物有限公司，BYL40828），蛋白预染Marker（Fermentas，SM1811），丽春红S（上海基尔顿生物有限公司，BYL40635），NC膜（millipore，HATF00010），脱脂奶粉（BD分装，BYL40422），PBS磷酸盐缓冲液（上海基尔顿生物有限公司，BYL40657），Tween-20  吐温 -20（美国Amresco，BYL40713），发光液（德国Millipore公司，WBKLS0100），Mu Opioid Receptor（英国Abcam，Ab134054），5-HT3A Receptor（英国Abcam，Ab13897），GAPDH（美国CST公司，#5174），羊抗兔HRP标记二抗（碧云天，A0208），驴抗山羊HRP标记二抗（碧云天，A0181），羊抗鼠HRP标记二抗（碧云天，A0216），石蜡（上海国药集团，69018961），甲醛（上海国药集团，10010018），二甲苯（上海国药集团，10023418），无水乙醇（上海国药集团，10092680），氨水（上海国药集团，10002118），苏木素（珠海BASO公司，714094），伊红（珠海BASO公司，BA4099），中性树脂（北京索莱宝，G8590），SDZ-V型电子针疗仪（苏州医疗用品有限公司）L-500低速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司，7009120394），Real-time检测仪（美国ABI公司，ABI-7300），低温冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司，TG-16M），旋涡振荡器（上海青浦泸西仪器厂，K30），电动匀浆机（德国FLUKO公司，PRO200）电泳仪（BIO－RAD 公司，型号 mini protean 3 cell），电转仪（PS-9，大连竞迈科技有限公司），芬兰雷勃酶标仪（上海雷勃生物技术有限公司，型号为MK3），移液器（吉尔森P型移液器 (Pipetman) ，法国Gilson公司，P2、P10、P20、P100、P200、P1000），水浴锅（Leica(莱卡公司)  HI1210水浴锅），成像系统（Tanon Tanon-5200），正置显微镜（OLYMPUS公司，CX41），恒温烘箱（上海恒一科学仪器有限公司，DHG-9023A），石蜡切片机（徕克公司，SQ2125），摊片机（徕克公司，PPTHK-21B），IMS图象分析系统（上海基尔顿生物科技有限公司），数码相机（NIKON公司，D5100）。1.3 Walker 256大鼠乳腺癌细胞        分别取1mL腹水接种到70g雌性Wistar大鼠腹腔内，6~7天后大鼠腹部膨隆后抽取5mL腹水，加入等量PBS震荡摇匀后1200r/min离心5min，清洗两遍，后将细胞浓度调整至1×105个/μL，置于冰盒内备用。取1mL配置好的肿瘤细胞液沸水浴灭活配置灭活细胞液。1.4 骨癌痛大鼠模型制作将动物用4%戊巴比妥钠麻醉（0.2mL/100g）。大鼠左腿剃毛消毒后，在膝关节位置手术0.5cm切口，暴露胫骨平台。用2mL注射器对抗胫骨平台钻孔，穿过胫骨平台后钻入骨髓腔。然后用10μL的微量注射器吸取4×105个肿瘤细胞缓慢注入到骨髓腔中，边注射边后退。注射完毕后停顿15秒，然后将针取出用无菌骨蜡封闭。假手术组注射等量高温灭活的肿瘤细胞，其他操作与骨癌痛模型组相同。1.5 机械性痛觉过敏的评估（Mechanical hyperalgesia test）在造模前一天，造模后第9天，第11天，第13天，第15天进行测痛。采用von-Frey纤维毛进行测痛，具体做法：将大鼠置于10cm×20cm×20cm的有机玻璃笼中静置30分钟，然后用von-Frey进行测痛，方法为up and down法[6]，先用标力（Target Force gms）为2的纤维毛刺激大鼠左侧脚掌，如果未出现缩足反射则增加标力的号码，直到出现缩足反射则减小号码，两次刺激间隔15s以上，号码最大为15号，最小为0.4号，反复测量八次。然后将测痛的结果转换为估值（Touch Test® Sensory Evaluators）。右侧测痛依此进行。1.6 干预方法电针组：在骨癌痛造模后第10天开始予以电针治疗。穴位取大鼠左侧“后三里”和“跟端”穴[7]。采用型号为0.16×7mm针灸针直刺，全部刺入；将电针接通两穴，频率为2Hz，强度为2的疏密波治疗30min，每日1次，连续治疗6d。腕踝针组：在骨癌痛造模后第10天开始予以腕踝针治疗。穴位根据腕踝针取穴特点取“跟端”穴。采用0.16×7mm针灸针沿皮肤缓缓刺入，然后用透气胶布固定。于下午四点开始，次日8点取下。癌痛组：癌痛组不予干预。假手术组：假手术组不予干预。防止大鼠将腕踝针咬掉，腕踝针留针期间所有大鼠均佩戴特制头套[8]。1.7 实验取材       所有大鼠均在造模后第16天水合氯醛麻醉后心脏灌注取材，每组取4只用PBS灌注后取新鲜脑和脊髓L4~L6节段在液氮中储存，用于后期实验。另外4只PBS灌注后用4%多聚甲醛固定后用于免疫组化观察。取大鼠左腿胫骨用于病理切片观察。1.8 胫骨组织观察       取骨组织在多聚甲醛中固定7天后，将组织修剪、脱钙、去除杂质后逐级脱水。后将骨组织二甲苯处理显现透明状态后，在恒温箱中浸蜡处理。包埋，切片后经HE染色法装片，通过显微镜观察相应部位形态，并拍照记录。1.9 RT-PCR检测大鼠脊髓节段5-HT3A表达       组织总RNA的提取：取冻存的新鲜组织于Trizol的匀浆管中匀浆后放于冰上，置于超净台上孵育5min后12000r/min，离心10min。吸上清于离心管中，加入氯仿后摇匀，室温静置2min，后4°C离心。吸取上清于新的离心管中，加入异丙醇，混合均匀，室温静置15min，后4°C离心，弃上清。加入1mL75%的无水乙醇（750μL无水乙醇+250μL DEPC水）漂洗沉淀，4℃，12000r/min，离心5min，弃上清；加入1mL无水乙醇，漂洗沉淀，4℃，12000r/min，离心5min，弃上清，室温干燥10min；加入40μL的DEPC水溶解RNA，置于-80℃冰箱保存备用。逆转录合成cDNA第一条链：反应体系：总体积10μL（DNase I×1μL，10×DNase I Buffer×1μL，RNA量×1ng，DEPC-H2O×5μL）；反应条件：37℃，30min；加1μL的EDTA；65°C，10min。反转录体系：总体积25μL（RNA-Primer Mix×12μL, 5×RT Reaction Buffer×5μL，25mM dNTPs×1μL，25U/μL RNase Inhibitor×1μL，200U/μL M-MLV Rtase×1μL，Oligo（dt）18×1μL，ddH2O(DNase-free)×4μL），反转录条件：反应程序：37℃，60min；85℃，5min；4℃，5min。RT-PCR扩增：反应体系：总体积25μL（SYBRGreen Mix×12.5μL，上游引物F×0.5μL，下游引物R×0.5μL，ddH2O×9.5μL，cDNA模板×2μL）；扩增条件：95℃ ，10min（95℃，15Sec；60℃，45Sec）×40；95℃,15 Sec； 60℃,1min；95℃,15 Sec；60℃, 15 Sec；循环40次。扩增引物：5-HT3A：Primer F 5' AAGAAGTGAGGTCGGACAAGAG 3'，Primer R 5' GGCTGACTGCGTAGAATAAAGG 3'；GAPDH：Primer F 5' TGGGCAAGGTCATCCCAGAG 3'，Primer R 5' GAGGCCATGTAGGCCATGAG 3'。1.10 Western blot法检测脊髓节段5-HT3A受体蛋白表达       将组织剪成细小的碎片，每个样本20mg组织加入150-250μl裂解液的比例加入裂解液（裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂），匀浆器匀浆直至完全裂解。裂解后的样品4°C，12000r/min离心15分钟，取上清，BCA法蛋白质定量后，加热变性后贮存于-80℃冰箱。取样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，每孔上样15ug，电泳后将样本转模至半干式转膜中（转模液48 mM Tris, 39 mM glycine, 0.04% SDS, 20%甲醇。）。丽春红染色法检测转模成功后，进行膜的封闭和抗体孵育。5%脱脂奶粉室温封闭1小时，一抗：5-HT3A（1:200），GAPDH（1：2000）稀释抗体，4 ℃孵育过夜。二抗：孵育一抗的膜用TBST洗涤3次，每次5min。随后根据用量，按照1:1000稀释HRP标记的二抗，与膜37℃孵育1h。用TBST洗涤3次，每次5min。ECL化学发光检测：配制ECL发光液，取ECL发光液A和B等量混匀，加在膜的正面暗室避光5分钟。倒掉显色液，用纸小心吸取显色液，在上面盖上一层平整的透明纸。将其放入成像系统中进行扫描。1.11 统计学处理统计学处理采用SPSS 21.0统计软件对数据进行分析，统计结果均用均数加减标准差（）表示。各组间均数比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间均数两两比较采用最小显著法（ＬＳＤ）法。其中，P＜0.05差异有统计学意义。2　结果2.1 各组大鼠体重变化       在大鼠胫骨种植肿瘤细胞后，我们观察到电针组、腕踝针组和癌痛组造模后第6天开始体重出现明显下降，假手术组体重呈增长趋势。造模后第6天假手术组与其他三组相比有差异（P＜0.01）。随时间推移造模后第6天到第14天假手术组和其他三组体重均有明显差异。       实验从第10天开始进行，持续六天。在第10天和第12天，电针组、腕踝针和癌痛组三组体重无明显差异，第14天电针组和腕踝针组与癌痛组相比出现明显差异（P＜0.01），电针组和腕踝针组大鼠体重出现回升，但是癌痛组体重未见明显抬升趋势。第14天电针组和腕踝针组无明显差异（P＞0.05），电针组和腕踝针组与癌痛组相比出现明显差异。癌痛组大鼠体重较之前趋势仍向下，电针组和腕踝针大鼠体重较14天没用明显波动。体重情况如图1（*：与癌痛组相比P＜0.05）。<img src="/Public/uploads/image/20180713/1531450805354935.png" title="1531450805354935.png" alt="QQ截图20180713105704.png" width="456" height="242" style="width: 456px; height: 242px;"/>2.2 各组大鼠机械痛2.2.1 手术侧机械痛阈       基础痛无差异（P＞0.05）。实验在第10天开始进行，我们在第9天进行测痛，结果疼痛有明显差异，假手术组优于其他三组，电针组、腕踝针组与癌痛组相比较无明显差异（P＞0.05）。第11天有明显差异（P＜0.01），假手术组疼痛评分明显优于其他三组，电针组、腕踝针组和癌痛组比较也有差异（P＜0.05），腕踝针组评分优于电针组和癌痛组，电针组与癌痛组比较无差异。第13天有明显差异，假手术组评分优于其他三组，电针组、腕踝针组和癌痛组比较有差异（P＜0.05），腕踝针评分优于电针组和癌痛组。第15天有明显差异，假手术组评分优于其他三组，电针组、腕踝针组和癌痛组比较有明显差异（P＜0.01），电针组和腕踝针组评分优于癌痛组，电针组和腕踝针组比较无明显差异（P＞0.05）。结果如图2（*：与癌痛组相比P＜0.05）。<img src="/Public/uploads/image/20180713/1531450887652965.png" title="1531450887652965.png" alt="QQ截图20180713105930.png" width="400" height="258" style="width: 400px; height: 258px;"/> 2.2.2 非手术侧痛阈变化       基础痛无差异（P＞0.05）。第9天疼痛有明显差异，假手术组与其他三组均有明显差异（P＜0.05），电针组、腕踝针组和癌痛组无明显差异（P＞0.05）。第11天有明显差异（P＜0.01），假手术组疼痛评分明显优于其他三组，电针组、腕踝针组和癌痛组比较无明显差异（P＞0.05）。第13天有明显差异，假手术组评分优于其他三组，电针组、腕踝针组和癌痛组比较无明显差异（P＞0.05）。第15天有明显差异，假手术组评分优于其他三组，电针组、腕踝针组和癌痛组比较有明显差异（P＜0.05），腕踝针组评分优于癌痛组。结果如图3（*：与癌痛组相比，P＜0.05）。<img src="/Public/uploads/image/20180713/1531451039634003.png" title="1531451039634003.png" alt="QQ截图20180713110253.png" width="447" height="277" style="width: 447px; height: 277px;"/>                                                                                    图32.3 大鼠胫骨组织观察       随机号选出骨组织石蜡切片，观察到骨癌痛鼠骨组织骨小梁破坏明显，骨组织被肿瘤细胞侵蚀，出现骨密度不均和骨皮质缺失，更严重的骨质破坏严重；而正常组骨小梁正常，骨质均匀骨髓充盈。结果如图4。<img src="/Public/uploads/image/20180713/1531451726552338.png" title="1531451726552338.png" alt="QQ截图20180713111324.png"/>图4中：图1：腕踝针组骨组织切片×4倍。图2：腕踝针骨组织切片×10倍。图3：电针组骨组织切片×4倍。图4：电针组骨组织切片×10倍。图5：癌痛组骨组织切片×4倍。图6：癌痛组骨组织切片×10倍。图7：假手术组骨组织切片×4倍。图8：假手术组骨组织切片×10倍。2.4 大鼠脊髓5-HT3A mRNA表达       在造模后第16天取大鼠脊髓相应节段，修整后使用RT-PCR检测脊髓5-HT3A受体mRNA表达。四组有差异（P＜0.01），电针组和腕踝针组与癌痛组比较均有明显差异（P＜0.05）电针组与腕踝针组差异并不明显（P＞0.05）。在造模后第16天，癌痛组5-HT3A表达最高，电针组和腕踝针组5-HT3A表达其次，假手术组5-HT3A表达最低。结果如图5（注：*表示与癌痛组有差异。） 2.5 大鼠脊髓5-HT3A受体蛋白表达       在造模后第16天取大鼠脊髓相应节段，修整后使用Western blot检测脊髓5-HT3A受体表达。脊髓中5-HT3A受体蛋白表达，在第16天时四组有明显差异（P＜0.01），假手术组明显低于其他三组。电针组和腕踝针组均低于癌痛组（P＜0.01）。并且可以观察到脊髓5-HT3A受体的表达，电针组和腕踝针组与假手术组相比有明显差异（P＜0.01）。结果如图6（注：*表示与癌痛组有差异，P＜0.05。）<img src="/Public/uploads/image/20180713/1531452631653745.png" title="1531452631653745.png" alt="QQ截图20180713112913.png"/>2.6 大鼠脊髓5-HT3A受体的定位       在造模后第16天取大鼠脊髓相应节段，石蜡切片后使用免疫组化观察5-HT3A受体表达的位置。我们观察到5-HT3A受体主要表达在感受伤害性刺激的背角浅层。对脊髓背角浅层区域阳性面积进行统计，发现电针组、腕踝针组和癌痛组脊髓背角区域阳性率高于假手术组（P＜0.05），且电针组和腕踝针组与癌痛组相比阳性率用差异（P＜0.05）。电针组和腕踝针组比较不明显。结果如图7、图8（注：*表示与癌痛组比较有差异，P＜0.05）。<img src="/Public/uploads/image/20180713/1531452698970415.png" title="1531452698970415.png" alt="QQ截图20180713113008.png" width="285" height="364" style="width: 285px; height: 364px;"/>图8中，图1：电针组50μm镜下脊髓背角浅层。图2：腕踝针组50μm镜下脊髓背角浅层。图3：癌痛组50μm镜下脊髓背角浅层。图4：假手术组50μm镜下脊髓背角浅层。3　讨论       癌症疼痛的状态极其复杂，因为肿瘤可能对软组织、骨骼、神经系统都产生了影响[9]。癌症引起的骨痛（CIBP）又是癌症晚期最常见的并发症[10]。可能包括肿瘤、炎症、神经病理性疼痛等多种疼痛的总和[11]。更加清楚的认识理解神经系统在CIBP中的特征和表现，对靶向治疗CIBP是至关重要[12]。Walker 256乳腺癌肉瘤细胞是一种优良的肿瘤细胞，很早之前Mao[13]等就使用它制作了Wistar雌性大鼠的胫骨癌痛模型。本实验所用模型在先前模型[14]基础上，预实验摸索合适实验干预实验，然后实施实验。      刘希江等[4]发现鞘内注射5-HT拮抗剂可显著缓解骨癌痛大鼠的疼痛。Zhang-Xiang等[15]发现下行易化系统激活脊髓5-羟色胺3受体参与介导骨癌痛形成。5-羟色胺3（5-HT3）作为一种经典的神经递质，广泛存在于中枢和外周神经系统中，发挥作用多种多样。疼痛发生时，外周神经节同时向外周和中枢投射，背根神经节细胞表达的5-HT3A和5-HT3B受体投射到脊髓背角浅层[16]。5-HT3A在中枢和外周神经系统中都有表达，但是5-HT3B大部分在外周神经节位置[17]。本模型骨癌痛造模位置在胫骨，疼痛传入神经沿背根神经传入到脊髓背角的中枢神经系统。观察此位置5-HT3A表达的变化可能更好的了解骨癌痛。       腕踝针对疼痛的治疗效果显著，并且在治疗癌症疼痛方面也有好的疗效[18, 19]。在临床治疗方面，腕踝针与电针有很多相似之处。近来，有研究表明电针对骨癌痛模型有好的疗效[20, 21]，并且有部分机制研究。但是并未有腕踝针或者电针关于下行易化系统中脊髓5-HT3的影响的研究。本实验研究发现电针和腕踝针调节了骨癌痛脊髓背角区域5-HT3A受体的表达水平，位置主要在脊髓背角浅层。       综上所述，跟据我们的研究推测，腕踝针和电针对骨癌痛的止痛机制可能与调节脊髓背角区域5-HT3A受体的表达有关。参考文献[1]JIMENEZ-ANDRADE J M, MANTYH W G, BLOOM A P, et al. 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