针刺对自发性高血压大鼠下丘脑室旁核炎症因子含量及TLR4表达水平的影响

2018/07/11 13:38

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姬彩硕，马思明1，杨娜娜2，田中雪2，杨静雯1，邵佳凯1，王雪蕊1，刘存志1（1首都医科大学附属北京中医医院，针灸神经调控北京市重点实验室，北京 100010；2北京中医药大学，北京 1000029）摘要：目的:旨在从下丘脑室旁核（hypothalamic paraventricular nucleus，PVN)中Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）蛋白调节炎症因子分泌角度探讨针刺降低自发性高血压大鼠（Spontaneously hypertensive rats，SHR)平均动脉压的作用机制。方法：30只自发性高血压大鼠随机分SHR组、针刺组和非穴组，每组10只。10只WKY大鼠作为正常对照组。采用经鼠尾无创血压仪测量平均动脉；采用RT-PCR技术检测下丘脑室旁核TLR4 mRNA的表达；采用Western Blot技术检测PVN中TLR4蛋白表达；采用ELISA法检测PVN中TNF-α、IL-6的含量。结果:与WKY比较，SHR组大鼠平均动脉压升高，PVN中TLR4 mRNA及蛋白表达增加，TNFα、IL-6含量增加；与SHR组比较，针刺组大鼠平均动脉压明显下降，PVN中TLR4 mRNA及蛋白表达减少，TNFα、IL-6含量减少；而非穴组无明显差异。结论：针刺可能通过抑制自发性高血压大鼠下丘脑室旁核中TLR4蛋白表达，减少TNFα、IL-6分泌，从而降低自发性高血压大鼠血压，这可能是针刺治疗高血压的机制之一。关键词：针刺；高血压；TLR4；炎症因子Key words：Acupuncture, Hypertension, TLR4, Inflammatory cytokines       高血压是一种常见的心脑血管疾病，具有病程长、发展较缓慢的特点，其发病机制较为复杂[1]。近年来有研究表明高血压发生发展及其靶器官损害与慢性低量炎症反应有关[2]。下丘脑室旁核（hypothalamic paraventricular nucleus， PVN）是脑内最重要的心血管调节中枢，在调节血压中起着重要作用。有证据表明脑内PVN中促炎因子的增加能够促进高血压的发生发展[3]。Toll样受体家族（Toll-like receptors，TLRs）是固有免疫中最主要的组成部分，是炎症信号传递的重要蛋白，能够启动多种与炎症反应相关的基因转录，导致炎症介质的释放[1],而Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4)是Toll样受体家族中最主要的蛋白。课题组既往研究发现，针刺太冲穴能够有效降低自发性高血压大鼠血压。本实验通过RT-PCR、Western Blot技术探究针刺太冲穴是否调节下丘脑室旁核中TLR4蛋白表达，减少炎症因子含量，从而降低自发性高血压大鼠血压。1 实验材料1.1动物      10 周龄SPF 级雄性SHR大鼠30只，WKY大鼠10只，体质量280～300 g，北京维通利华技术有限公司，许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于中国中医科学院基础理论研究所SPF 级动物实验室。1.2主要试剂及仪器       ELISA试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司），TLR4抗体（美国Santa Cruz Biotechnology 公司），β-actin（北京康为世纪生物科技有限公司），二抗（美国Cell Signaling Technology 公司）。电泳仪（北京六一仪器厂），凝胶成像仪Tanon EPS300（上海天能科技有限公司），离心机（美国Beckma），一次性无菌针灸针（华佗牌）2 试验方法2.1 分组30只自发性高血压大鼠（SHR）大鼠随机分为SHR组、针刺组和非穴组，每组10只。另取10只WKY大鼠作为正常对照组。2.2 干预       适应环境后第2日进行干预。取双侧“太冲穴”[4]，行捻转泻法各30 s，留针10min。非穴组大鼠选取其足背侧,第三、四跖骨结合部之前凹陷处作为对照刺激点，行平补平泻捻转手法各30 s，留针10min。每日1 次，治疗6 d，休息1 d，2 周共治疗12次。正常组和模型组行与针刺组和非穴组相同时间、相同程度的捉抓刺激。2.3 检测指标      每天针刺后检测各组大鼠血压值。治疗结束后第2 日，各组大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠（0.2ml/100g)麻醉。大鼠麻醉后断头快速取出脑组织，-80℃冰箱保存。2.3.1 平均动脉压测量       采用无创鼠尾动脉仪测量平均动脉压。在安静环境下，将大鼠放入限制其活动的固定器内，调节恒温毯至37-38℃，用血压感受器套住大鼠尾部近心端，调整鼠尾和压力感受器接触部位，调节仪器感知。设定大鼠血压域值（<190mm Hg），待大鼠安静、显示器规律摆动时，按下Start键，仪器自动测量血压，仪器测压结束后，记录收缩压、平均动脉压以及舒张压。每只大鼠自动测量3次，取平均值。2.3.2 炎症因子测定     采用ELISA法测定下丘脑室旁核中 TNFα、IL-6炎症因子含量。按照ELISA试剂盒说明操作，用分光光度仪测定。2.3.3 TLR4基因表达测定          采用RT-PCR技术测定下丘脑室旁核TLR4基因表达。Trizol 法提取各组细胞总RNA，按逆转录试剂盒说明书进行逆转转录，用荧光定量PCR扩增，PCR反应条件为: 95℃ 5 min，94 ℃20s，56℃ 20 s，72 ℃20 s，72℃5min，55℃10 s，40个循环，β肌动蛋白为内参。引物序列如下: TLR4上游5'-ACAT CAAA TGCC CCTACTCA-3'，下游 5'-CTAAACCAGC-CAGACCTTGA-3';β- actin上游 5'-CATTAAG-GAGAAGCTGTGC-3',下游5'-GTTGAAGG-TAGTTTCGTGGA-3'。    2.3.4 TLR4蛋白表达测定       采用Western Blot技术测定下丘脑室旁核TLR4蛋白表达。将下丘脑组织从脑中分离，常规匀浆提取总蛋白，置于－80℃以备后用。用BCA法测定蛋白浓度。蛋白变性后，每组蛋白取20μl上样与10%SDS-PAGE胶，电泳2 h；用湿转移的方法转印到PVDF 膜上，转完后将膜用5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h；加入特异性的一抗（TLR4 1:200），4℃孵育过夜；TBST 液漂洗4 次（5 min/次），加二抗（1:5000），避光室温孵育1 h，TBST液漂洗后，采用Odyssey近红外双色激光成像分析软件处理，记录每条蛋白电泳带的平均光密度值，进行定量分析3 统计学方法      采用SPSS17. 0 统计软件进行分析。数据用均数±标准差(±SD) 表示，组间比较用单因素方差分析，并用Tukey 法( 方差齐时) 或Dunnett' s T3( 方差不齐时) 作组间多重比较。4 结果4.1针刺对自发性高血压大鼠血压的影响        与WKY 组比较，SHR 组各时间点平均动脉压均明显升高(p<0.01)；与SHR 组比较，针刺组各时间点平均动脉压明显降低（P<0.05）；与非穴组比较，针刺组各时间点平均动脉压明显降低（P<0.05）。组内时间效应及交互效应的统计分析表明，各时间点对平均动脉压有影响(p<0.05)，时间同组别无交互作用(p>0.05)。<img src="/Public/uploads/image/20180711/1531286419842032.png" title="1531286419842032.png" alt="QQ截图20180711131831.png" width="455" height="245" style="width: 455px; height: 245px;"/>注：与WKY 组比较，#p<0.05；与SHR 组比较，*p<0.05；与非穴组比较，&p<0.05。4.2 针刺对自发性高血压大鼠下丘脑室旁核中炎症因子的影响      采用ELISA方法观察下丘脑室旁核中炎症因子的含量变化。如图所示，与WKY组相比，SHR组TNFα、IL-6含量显著增加（P<0.05）；与SHR组和非穴组相比，针刺组能够明显减少TNFα、IL-6含量（P<0.05）。<img src="/Public/uploads/image/20180712/1531378625555929.png" title="1531378625555929.png" alt="QQ截图20180712145536.png" width="529" height="213" style="width: 529px; height: 213px;"/>4.3针刺对自发性高血压大鼠下丘脑室旁核中TLR4的影响       采用RT-PCR技术观察TLR4基因表达。与WKY组相比，SHR组TLR4 mRNA表达明显增加（P<0.05）；与SHR组和非穴组相比，针刺组TLR4 mRNA表达明显减少（P<0.05）。通过Western Blot观察下丘脑室旁核TLR4的蛋白表达。与WKY组相比，SHR组TLR4蛋白表达明显增加；与SHR组和非穴组相比，针刺组TLR4蛋白表达明显减少。<img src="/Public/uploads/image/20180712/1531378677734625.png" title="1531378677734625.png" alt="QQ截图20180712145633.png" width="470" height="211" style="width: 470px; height: 211px;"/> 3、讨论中医相关的古代文献并无高血压病名，而现代医家根据高血压的临床表现和病程演变，以及临床经验，把高血压病归于眩晕、头痛等病中。对于眩晕病症的认识，中医历代医家有不同的论述，认为眩晕属肝所主，与髓海不足、血虚、邪中等多种因素有关。《素问·至真要大论》云：“诸风掉眩，皆属于肝”；《证治汇补·卷之四》：“以肝上连目系而应于风，故眩为肝风”；肝木旺，风气甚，故头目眩晕。有临床研究表明，针刺能够降低高血压患者治疗期间24h内收缩压与舒张压[5]。有基础实验表明，针刺高血压动物模型能够降低血压、减少氧化应激损伤、降低炎症反应[6-8]。太冲是肝经原穴，是治疗原发性高血压的首选穴位。太冲穴出自《灵枢·九针十二原》：“阴中之少阴肝也，其原出于太冲，太冲二”[9]。太，大的意思；冲，重要部位、要冲的意思。穴在脉气盛大之处，故名太冲[10]。针刺太冲具有疏肝理气、补益肝肾、平肝潜阳、理气调血之功效。自发性高血压大鼠是国际上公认的最接近人类原发性高血压的动物模型，能很好的复制高血压的生理病理过程。在心血管活动中起着重要的调节作用。炎症反应在高血压等心血管系统疾病的病理生理过程中普遍存在[11]。组织中的炎症反应能够引起高血压产生，促进其发展，最终造成靶器官的损伤。有研究表明，自发性高血压大鼠PVN中的促炎因子增加，可以升高其平均动脉压。TLR4是Toll样受体家族中最明确参与高血压发生发展的分子[12]。Bomfim和DeBatista等人发现，在自发性高血压大鼠模型（SHR）和血管紧张素II诱导的高血压模型中，TLR4能够明显促进内皮功能损伤，升高血压[13-15]。Dange等人发现，抑制下丘脑室旁核中TLR4表达能够减少到自主神经功能障碍，减少炎症因子的生成，从而使自发性高血压大鼠血压下降[3]。本研究通过ELISA、RT-PCR、Western Blot等技术发现针刺能够降低自发性高血压大鼠血压，减少PVN中TLR4蛋白表达及炎症因子的含量。综上所述，针刺可能影响自发性高血压大鼠PVN中的TLR4蛋白表达，减少炎症因子的含量，从而降低血压水平。提示针刺治疗高血压的作用机制可能与抑制TLR4通路、降低炎症反应有关。 参考文献[1]程啸竹,董昌武,濮燕屏.TLR4 炎症信号通路在高血压中的研究进展[J].安中国中医药现代远程教育，2016，14（15）:146-148.[2]Echem C, Bomfim GF, Ceravolo GS, et all.nti-toll like receptor 4 (TLR4) therapy diminishes cardiac remodeling regardless of changes in blood pressure in spontaneously hypertensive rats (SHR)[J].Int J Cardiol. 2015;187:243-5.[3]Dange RB, Agarwal D, Teruyama R ,et all.Toll-like receptor 4 inhibition within the paraventricular nucleus attenuates blood pressure and inflammatory response in a genetic model of hypertension[J].J Neuroinflammation. 2015 ;12:31.[4]华兴邦,李辞蓉,周浩良.大鼠穴位图谱的研制[J].实验动物与动物实验,1991(1)：1-5.[5]Flachskampf FA,Gallasch J,Gefeller O ,et all.Randomized trial of acupuncture to lower bloodpressure[J].Circulation.2007 ;115(24):3121-9.[6]Yang M, Yu Z, Deng S,et all.A Targeted Metabolomics MRM-MS Study on Identifying Potential Hypertension Biomarkers in Human Plasma and Evaluating Acupuncture Effects[J].Sci Rep. 2016 ;6:25871.[7]Yang J, Su B, Zhang J, Liang J,et all.Proteomic response to acupuncture treatment in spontaneously hypertensive rats[J].PLoS One. 2012;7(9):e44216.[8]Oh YI, Yang EJ, Choi SM,et all.The effect of electroacupuncture on insulin-like growth factor-I and oxidative stress in an animal model of renal failure-induced hypertension[J].Kidney Blood Press Res. 2012;35(6):634-43.[9]灵枢经[M].北京：人民卫生出版社，2007,2: 4[10]张永臣，贾红玲等编著.人体特效穴位之五输穴 [M]. 北京：科学出版社2010,1:194[11]Hiroshi K. 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