TLR2、TLR4与心肌缺血再灌注损伤的研究进展

2018/05/09 14:28

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朱　怡，东红升，东贵荣(中国上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院针灸科，上海 200437)摘要：Toll 样受体( Toll-like receptors，TLRs)属于模式识别受体( pattern recognition receptors，PRRs)家族, 是固有免疫的基本成员。越来越多的研究表明，TLRs在心肌缺血再灌注损伤的炎症反应中起了重要作用，其中TLR2和TLR4的研究最为广泛。心肌细胞在缺血再灌注后合成释放一些物质能与TLR结合，激活核转录因子等而产生炎症反应，影响左心室重塑。本文就TLR2、TLR4在心肌缺血再灌注损伤中的作用作一综述，初步阐明TLRs影响心肌缺血再灌注损伤的机制，为临床治疗提供新思路。关键词：针灸学；Toll样受体2；Toll样受体4；信号转导；心肌缺血再灌注损伤       免疫系统由先天免疫和获得性免疫系统组成。模式识别受体（PRRs）是先天免疫应答中最具有代表性的受体，目前已被报道的模式识别受体有：Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)；表达在膜上的 C 型凝集素受体( C-type lectin receptor，CLR)；表达在胞质的 NOD 样受体( NOD-like receptor，NLR)；RIG-I 样受体( RIG-I-like receptor，RLR) 和胞质多种 DNA 感应分子等[1]。而TLRs是第一个被发现并研究最深入的模式识别受体，它是固有免疫的基本成员，是细胞表面的一类天然免疫受体。近年来的研究表明TLRs在心肌缺血再灌注损伤的炎症反应中起了重要作用，本文就TLR2和TLR4在心肌缺血再灌注损伤中的研究进展做一个综述。1. TLRs概述       1998年Beutler在果蝇身上发现与Toll基因同源的TLR4是识别细菌脂多糖的受体后，Toll 样受体( Toll like receptor，TLR) 其他成员陆续被发现，至今，在人体中至少有11种TLRs被发现，统称为TLRs家族，TLR是属于I型跨膜受体蛋白，其组成分为三个区，分别为胞内区、胞外区和跨膜区。TLRs分布十分广泛，介导一系列重要的免疫应答，可以直接识别、结合某些病原体或其产物所共有的高度保守的特定分子结构，并引发一系列信号转导，进而导致炎性介质的释放，在炎症、免疫中起十分重要的作用。TLRs不仅表达于单核细胞、中性粒细胞等各种免疫细胞，还在心肌细胞、内皮细胞、外膜纤维原细胞等实质细胞中均有表达。TLR1普遍表达于各类免疫细胞,TLR2、4、5的分布则是除B、T和NK细胞以外的免疫细胞,TLR3只特异分布于树突细胞［2］。根据分布的位置的不同，TLRs可以分为细胞表面和细胞内的TLRs，TLR1、2、4、5、6均分布于细胞表面，而TLR3、7、8、9则位于细胞内。2. 分子模式2.1.PAMP病原相关分子模式       病原相关分子模式（PAMP）是一种在分子组成和构型上保守的能够识别病原微生物并且可使宿主细胞区分自己和非己，激活与天然免疫相关的信号转导通路的识别方式，是微生物基本的功能成分。目前公认的PAMPs有：脂多糖LPS(lipopolysaccharide)、肽聚糖(PGN)、脂磷壁酸（LTA)、甘露聚糖和葡聚糖、非甲基化(CpG)-DNA和双或单链RNA(ssRNA)[3]。2.2.DAMP损伤相关分子模式     细胞在受到损伤或其他情况下，如暴露于病原体、毒素或缺血再灌注损伤时了，可释放出一类物质诱导免疫应答的发生，释放出来的这些物质被称为损伤相关的分子模式(danger/damage-associated molecular patterns, DAMP)。病理情况下，细胞裂解后会将其内容物释放出来，而不是像正常细胞那样在裂解前自我消化，这些释放出来的产物可以被Toll样受体识别诱导免疫应答。目前公认的DAMP有HMGB1、S100蛋白、透明质酸、热休克蛋白、补体C3a、尿酸、腺苷三磷酸等[4]。3.TLRs配体       TLRs配体（ligand）根据来源可分为外源性配体和内源性配体[5]。外源性配体的来源主要是病原微生物，而内源性配体的来源是宿主细胞，当机体感染期时，TLR对其配体的识别将触发机体防御性的先天免疫反应，主要是通过激活不同胞内级联通路，最终导致炎性细胞因子、趋化因子、共刺激分子、主要组织相容性复合物及多重效应分子基因的表达[6]。不同的PAMPs由受体识别后将启动不同胞内级联通路的活化，导致多种效应分子的基因表达，如炎性细胞因子、趋化因子、共刺激分子、主要组织相容性复合物及多重效应分子等[7]，从而成为生物抵御外物入侵的第一道防线。4.TLRs信号转导通路     TLRs识别配体后，可通过一系列的跨膜信号传导，传递至细胞内的接头分子，目前已知的有五种接头分子——髓样分化因子88（MyD88）、MyD88样接头蛋白（Mal）、TLRs相关的干扰素活化因子（TRIF）、TRIF相关接头分子（TRAM）和SARM。TLRs信号传导通路根据是否包含MyD88可以分为MyD88依赖性和MyD88非依赖性/TRIF依赖性传导通路。TLR1、2、6、7和9介导的信号传导途径为MyD88依赖性传导通路，而TLR3介导的信号传导途径只有TRIF依赖性通路，TLR4则两者均有。4.1.MyD88依赖性信号转导通路       在此信号通路中，MyD88参与了除TLR3以外的TLRs家族信号传导，因此起到了关键的作用，MyD88是由可与受体结合的C端的TIR结构域、中间域和N端具有一个与肿瘤坏死因子受体胞内区先关的死亡结构域（DD）组成的[8]，经配体刺激后C段TIR结构域可与受体结合，DD结构域可募集下游的IL-1受体相关激酶（interleukin-1 receptor associated kinase，IRAK-1）、转化生长因子-B1活化激酶和肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNFR-associated factor 6，TRAF6）等信号分子，促使核因子（nuclear factor，NF）-κB、激活蛋白（activating protein，AP）1和P38促丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）活化，继而调控炎性基因转录[9-11]。4.2.TRIF依赖性信号转导通路      目前研究表明，TRIF是一种含有TIR的转接蛋白，在Toll样受体的MyD88非依赖性信号途径中发挥重要作用[12]，能活化IRF-3，诱导IFN-B基因的表达，进而影响干扰素诱导基因的转录[13]。 TRAM(TRIF-related adaptor molecule)是连接TRIF和TLR4的是转接蛋白TRIF相关接头分子，含有TIR结构域，可不依赖MyD88而激活转录因子IRF-3、IRF-7和NF-κB [14]，从而诱导炎性基因表达，引起一系列炎症反应。4.3.P13K/Akt信号转导通路       目前最新的一项研究表明，减少TLR4的表达可以激活PI3K/Akt信号转导通路。Hua通过研究结果表明，TLR4缺陷小鼠心肌缺血再灌注后，NF-κB的活化程度明显降低了（Hua，et al，2007）。在缺血在灌注损伤模型中，TLR4缺陷小鼠与野生型小鼠相比较，心肌Akt磷酸化程度增高。通过将PI3K拮抗剂预处理心肌缺血再灌注小鼠得出结论，PI3K拮抗剂能够完全阻断心肌缺血再灌注小鼠的心肌损伤保护功能，PI3K拮抗剂抑制PI3K/Akt信号转导通路后，预处理的损伤保护作用消失，表明除了传统认为的TLR4信号转导通路，PI3K/Akt信号转导通路在LPS预处理诱导的保护中发挥重要的作用，而缺血/再灌注中LPS造成的组织损伤则依赖于TLR4-NF-κB信号转导通路。 5.TLR/ NF-κB信号通路与心肌缺血再灌注损伤       虽然先天免疫和炎症反应介导心肌缺血再灌注损伤的机制尚未完全明确，但越来越多的研究表明TLR介导的信号转导通路的激活和炎性反应的发生在心肌缺血再灌注损伤中起到了重要的作用[15, 16]。TLR介导的信号转导通路主要是激活NF-κB诱导炎症基因的转录[17]。NF-κB是在鼠的B淋巴细胞中发现的能与免疫球蛋白K轻链基因增强序列特异性结合的调控因子，能诱导刺激相关基因的表达，特别是促进炎症反应基因的表达，并在缺血再灌注心肌细胞和潜在的缺血细胞中表达增高[18]。Li等人通过实验证实I/R能迅速提高心肌IKKβ的活性，促进IkBa磷酸化/去磷酸化并激活NF-κB(Li et al，2001)。削弱NF-κB活性后能够显著降低心肌缺血再灌注损伤程度，促进心脏功能的恢复[19]，下调炎性细胞因子和粘附分子的基因表达。在TLRs家族中，TLR2和TLR4对心肌缺血再灌注损伤作用的研究最为广泛。5.1.TLR4/MyD88信号通路与心肌缺血再灌注损伤5.1.1.TLR4缺陷能降低I/R后心肌梗死的程度       继Frantz等在人和大鼠的缺血心脏中检测出TLR4的表达增加之后，越来越多的研究证实了TLR4介导的信号转导通路在I/R损伤中起到了重要作用。TLR4基因缺陷和使用TLR4拮抗剂都能够削弱NF-κB活性，减轻I/R后的炎性反应[20]。Zhai等人证实TLR4缺陷小鼠与野生型小鼠相比心肌梗死的面积小(Zhai，et al，2015)。Shimamoto A等人通过实验得出结论给小鼠服用TLR4拮抗剂能够有效减少心肌缺血再灌注小鼠的心肌梗死面积(Shimamoto，A et al，2006)。MyD88是TLR4介导的信号转导通路中一个重要的衔接蛋白，阻断MyD88依赖性信号转导通路能显著降低I/R损伤程度[21]。IRAK-4是Toll样受体介导的MyD88依赖性信号转导通路中一个重要的下游激酶。IRAK-4缺陷能改善小鼠梗死后4周的存活率，减少梗死心肌的炎症反应，表现出减毒的心脏扩张[22]。综上所述，TLR4介导的MyD88依赖性信号转导通路在心肌缺血再灌注损伤中具有重要的作用，这为今后的治疗提供了方向。5.1.2.TLR4/MyD88信号通路导致心脏功能障碍       心脏功能障碍是心肌缺血再灌注损伤后的一个重要表现。TLR4介导的MyD88依赖性信号转导通路影响着心肌重构和心脏功能，在I/R早期，心肌细胞中表达的TLR4对心功能障碍起主要的作用，而在后期，心肌细胞和炎症细胞中的TLR4对心功能障碍均产生重要的影响。通过抑制心肌缺血再灌注大鼠心肌细胞中TLR4的表达，能有效降低心肌细胞的损伤，改善心脏功能[23]。Wang等人的实验证实抑制TLR4-NF-κB信号通路能够有效地减少中性粒细胞浸润，减轻炎症反应，从而减少I/R心肌细胞的凋亡，改善心脏功能（Wang，et al,2015）。Fallach等人研究证实TLR4缺陷能够显著的改善I/R后心脏的功能，与野生型小鼠相比较，TLR4缺陷小鼠的心功能在I/R后6天能够有显著的改善，梗死的面积小并且左心室重建减少，并且研究者将BM嵌合体移植到造血干细胞系统中替代TLR4的表达，结果观察到，在心肌细胞中表达TLR4的嵌合体小鼠在I/R或者内毒素刺激后4小时就表现出心脏功能的障碍，说明心肌细胞中表达的TLR4能改善I/R模型小鼠和脓毒症模型小鼠的心脏功能(Fallach et al,2010)。Binck等人通过实验证实，内毒素作用18小时后，无论是在造血系统还是在心肌细胞中， TLR4的表达都对心功能障碍产生影响。综上所述，无论是I/R后早期还是晚期，TLR4基因缺陷和对TLR4/MyD88信号通路的调控均能显著改善心脏功能（Binck et al，2005）。5.1.3.TLR4配体与心肌预处理保护      许多研究证实了，损伤前24小时给动物小剂量LPS预处理可以抗I/R损伤，改善I/R后心脏功能，降低心肌梗死的面积[24]。这种现象不仅限于LPS，还可以由一种革兰氏阳性菌的细胞壁的组成成分LTA产生，而LPS和LTA是TLR4的配体。这提示了小剂量的TLR4受体激动剂可以诱导心脏保护，这种现象被称为是预处理[25]。近期的一项研究表明通过卵泡抑素预处理，可以显著减少细胞凋亡，并通过抑制MyD88依赖性信号转导通路降低心脏的损伤程度[26],LPS预处理可以激活PI3K/Akt信号转导通路，这条转导通路对TLR/NF-κB介导的炎性反应有负向调节作用[27]。Ha等通过实验证实了LPS诱导的心脏保护的机制是通过PI3K/Akt依赖性信号转导通路介导的产生的，激活PI3K/Akt依赖性信号转导通路可以保护I/R后心肌细胞的损伤，阻碍I/R诱导的心肌细胞的凋亡（Hua et al，2008）。5.2.TLR2信号通路与心肌缺血再灌注损伤5.2.1,。TLR2与心肌缺血再灌注损伤目前许多研究也证实了TLR2在心肌缺血再灌注损伤中的作用。Abarbanell等人在缺血再灌注损伤前5分钟，用MSCs预处理野生型和TLR2缺陷型小鼠的离体心脏，结果显示，野生型小鼠的心脏左心室的恢复能力显著提高，而TLR2缺陷小鼠的心脏没有表现出差异（Abarbanell，et al，2010）。Sakata等通过在体外循环的缺血再灌注损伤的心脏，比较TLR2缺陷小鼠与野生型小鼠左心室血压的恢复情况，结果显示，野生型小鼠左心室血压恢复要低于TLR2缺陷小鼠（Sakata，et al，2007）。Favre等和Arslan等通过实验证明，在心肌缺血再灌注损伤后，TLR2缺陷小鼠心肌梗死面积小于野生型小鼠。将BM细胞移植到TLR2缺陷小鼠体中后，TLR2缺陷小鼠表现出抗心肌缺血再灌注损伤保护的作用，提示了循环细胞中表达的TLR2能介导心肌缺血再灌注损伤。而且，在再灌注之前5分钟注射抗TLR2抗体能够持续28天有效地改善心功能状态，减少梗死面积、炎性细胞因子的产生和减轻细胞凋亡信号转导通路的激活（Favre，et al，2007；Arslan ，et al，2010）。5.2,2. TLR2配体抗心肌缺血再灌注损伤       目前的研究显示，TLR2对缺血预适应中心肌缺血再灌注后左心室恢复表现出重要的作用[28]。给野生型小鼠心脏一个特定的合成的TLR2配体Pam3CSK4，能够显著的改善I/R后左心室功能的恢复。Mersmann等人通过实验证实，在心肌缺血再灌注损伤24小时之前给小鼠体外注射Pam3CSK4，能够减少梗死面积，改善心功能，减少趋化因子和减轻缺血组织白细胞的浸润（Mersmann， et al，2010）。虽然很多研究证实，预处理诱发的保护需要至少提前8-24小时进行预处理。但有研究证实，在心肌缺血再灌注损伤前1小时注射TLR2配体，无论是Pam3CSK4还是PGN均能有效减少梗死面积，改善心功能。然而Pam3CSK4不能诱导TLR2缺陷心脏的心功能恢复，表明TLR2配体诱导缺血预适应的作用是通过TLR2依赖性的机制产生的[29]。Ha等人通过实验观察到，TLR2配体可以显著增加心肌组织中磷酸化Akt的水平，PI3K/Akt信号转导通路被TLR2激活。更重要的是，阻断PI3K或者减弱Akt能阻碍TLR2配体诱导的心肌保护，提示TLR2诱导的心脏保护功能是通过TLR2/PI3K/Akt依赖性机制介导的（Ha T，et al，2010）。6.讨论       综上所述，TLR2和TLR4介导的信号转导通路在心肌缺血再灌注损伤的发生发展中起到了重要的作用，TLR2和TLR4基因缺陷以及TLR2和TLR4配体具有抗心肌缺血再灌注损伤的作用，二者配体对心脏保护的机制是均是通过PI3K/Akt依赖性信号转导通路介导的产生的，除了抑制TLRs信号通路，对PI3K/Akt依赖性信号转导通路的调控成为我们今后新的治疗靶点。       虽然目前对Toll样受体信号转导通路与心肌缺血再灌注损伤的关系研究较多，但除了TLR2和TLR4以外，其他的Toll样受体以及与TLR2、TLR4信号转导通路相关的因子研究并不明确，因此深入研究TLRs信号通路以及相关因子应是今后研究的重要方向。参考文献[1]，Hennessy EJ, Parker AE, O’Neill LAJ. Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics? 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