SAMP8海马CA1区突触素的表达及针刺的干预作用

2018/05/09 13:24

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阚伯红1,2，王　煜1,2，王一婧3，高　青3，赵　岚1,2，范英昌3 （1天津中医药大学第一附属医院针灸研究所，天津市西青区昌凌路88号，天津 300381；2天津市针灸学重点实验室，天津市西青区昌凌路88号，天津 300381；3天津中医药大学，天津市南开区鞍山西道312号，天津 300193）摘要：研究目的：突触素是突触发生和重塑的重要标志，本研究目的在于观察早老性痴呆模型鼠SAMP8海马突触素的表达变化以及针刺对其表达的影响。研究方法：将30只8月龄SAMP8分成模型P8组和针刺组，以同月龄抗老化小鼠SAMR1为正常对照R1组，采用HE染色法观察各组小鼠海马CA1区椎体细胞形态的改变，以real-time PCR和免疫组化学法观察各组小鼠海马CA1区突触素基因和蛋白的表达情况。研究结果：研究发现SAMP8海马CA1区的椎体细胞排列、形态及结构都明显受到损伤，针刺对其有改善作用。进一步研究发现P8组海马突触素基因和蛋白的表达量与R1组相比，明显减少（P＜0.05），而针刺能增加其表达量（P＜0.05）。结论：结果表明SAMP8海马突触存在分子和形态学的损伤，针刺可通过增加突触素的表达发挥治疗AD的作用。关键词：针灸推拿学；针刺；阿尔茨海默病；SAMP8；突触素       阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种常见的神经退行性疾病，主要表现为进行性记忆的缺损、认知的损害和定向力障碍等，严重威胁老年人的身心健康。伴随我国人口的老龄化加剧，AD给家庭和社会造成沉重的经济负担，成为制约社会发展的重要因素。AD属突触障碍性疾病范畴[1]。突触素(Synaptophysin, SYP)是特异性存在于突触前囊泡膜表面上的一种蛋白质，其密度间接反映突触的数量、分布和密度[2]。过去研究表明三焦针法可明显改善AD的临床症状[3]，但其作用机制有待进一步研究，尤其是对突触的影响。1 材料和方法1.1主要试剂 mRNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和SuperReal荧光定量预混试剂盒均购自天根生化科技有限公司。引物由华大科技合成，SYP上游引物（AGTGCCCTCAACATCGAAGTC），下游引物（CGAGGAGGAGTAGTCACCAAC）；内参为GAPDH，上游引物（AGGTCGGTGTGAACGGATTTG），下游引物（TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA）。兔抗小鼠多克隆抗体SYP购自美国Abcam公司。即用型SABC（过氧化物酶）试剂盒（SC1022）、DAB显色试剂盒（AR1022）、防脱玻片和封闭用正常兔血清均购自武汉博士德公司。多聚甲醛、甲醛、水合氯醛、二甲苯、无水乙醇、伊红和苏木素等均为国产分析纯级。1.2主要仪器微量生物分光光度计（DeNovix，DS-Ⅱ，美国）、梯度PCR仪（ABI， ProFlex，美国）、实时定量PCR仪(Roch，LightCycler@ 96，瑞士)、万分之一天平（梅特勒-托利多，AE200，德国）、自动脱水机（Leica，TP1020，德国），自动包埋机（Leica，EG1150H，德国），自动切片机（Leica，RM2555，德国）、摊片机（Leica，HI1210，德国）光学显微镜（Leica，DM3000，德国），LAS图像分析系统（Leica，4.0，德国），恒流泵、恒温箱、冰箱和微波炉均为国产。1.3实验动物分组及处理：以8月龄快速老化小鼠SAMP8为模型对照组（P8组），以同月龄抗快速老化小鼠SAMR1组为正常对照（R1组），治疗组（针刺组）对SAMP8给予三焦针法进行干预[4]，其余各组行相同程度的捉抓210秒。1.4取材、提取总RNA、逆转录和定量PCR：将小鼠麻醉后脱臼处死，取得海马组织CA1区组织，放入无RNA酶的EP管中，加入裂解液，以研磨棒研磨，按照试剂说明书提取总RNA，测得RNA浓度，按照逆转说明说合成第一链，每20μL反应体系加入RNA的量为1.25μg。每20μL PCR反应体系中加入模板的量为1μL，引物的终浓度为0.5μM，退火温度为60℃，其他参照说明书。1.5脑组织切片的制作小鼠脑组织灌注方法参见李灵芝报道[5]，对进针深度略作改动，有落空感是停止进针，其它步骤不变。用0.1 mol/L PB（PH 7.4）充分冲洗，修块，取含海马的脑组织，常规脱水、透明和浸蜡，石蜡包埋，用莱卡全自动切片机连续冠状切片，片厚5 μm。贴于预先防脱处理的载玻片上，于60℃烤片30分钟，行HE和免疫组织化学染色。1.6HE染色步骤（1）切片常规用二甲苯脱蜡，经梯度乙醇脱水至水化。苏木素染色，盐酸乙醇分化，温水冲洗，伊红液染色后常规脱水，透明，封片。1.7SABC法免疫组化切片常规脱蜡至水；3%H2O2孵育10 min，以封闭内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水洗3次，每次2 min；流水冲洗5 min；1/100枸橼酸钠溶液，高压2分钟抗原修复。冷却后0.02 M PBS洗1-2次，每次2 min；用兔抗血清50 μl封闭，湿盒内室温封闭45 min；倾去封闭液（不洗），滴加兔抗SYP（1:1000）50 μL，于湿盒内4℃过夜（约12 h）；复温30 min，0.02 M PBS洗洗3次，每次2 min；滴加生物素标记的山羊抗兔IgG 50 μl，湿盒内孵育45 min；0.02 M PBS洗洗3次，每次2 min；滴加试剂SABC 50 μl，湿盒内室温孵育20 min；0.02 M PBS洗4次，每次5 min；DAB镜下控制显色；自来水冲洗10 min；其余步骤同HE染色。1.8 图像分析在海马CA1区域内，每只小鼠区3张切片于20倍物镜下随机选取5个视域，以LAS 4.0软件系统摄像并进行分析，测量SYP阳性反应物的平均光密度值，每张切片的5个视野取其平均值，对每组切片的平均光密度值进行统计分析， 1.9 所有数据用均数±标准差（±s）表示，并采用SPSS17.0统计软件处理。如数据符合正态分布，方差齐性，采用单因素方差分析，检验水准定为P﹤0.05为差异有显著性。2 结果2.1 形态学观察R1组海马CA1区椎体细胞排列紧密，形态规则，结构完整有大量的神经纤维发出。而P8组椎体细胞排列松散，形状欠规则，结构不完整，神经纤维不明显，针刺组略有改善（如图1）。<img src="/Public/uploads/image/20180509/1525843388321039.png" title="1525843388321039.png" alt="QQ截图20180509132158.png"/>         SYP mRNA的量反应各组中该基因在转录水平的变化。经统计学分析各组数据呈正态分布，方差同质，两两间差异显著（P=0.000＜0.05，N=6），与正常对照R1组相比，P8组SYP的基因表达量（0.32±0.04）明显降低（P=0.000＜0.05，N=6），针刺对其有正向调节作用（P=0.035＜0.05，N=6），但其表达量（0.41±0.039）仍低于R1组（P=0.000＜0.05，N=6）。（见图4） <img src="/Public/uploads/image/20180509/1525843553283800.png" title="1525843553283800.png" alt="QQ截图20180509132225.png" width="469" height="279" style="width: 469px; height: 279px;"/><img src="/Public/uploads/image/20180509/1525843563657768.png" title="1525843563657768.png" alt="QQ截图20180509132341.png" width="387" height="257" style="width: 387px; height: 257px;"/>3 讨论      海马是大脑边缘系统的一个重要组成部分，在信息处理中起重要作用，是学习记忆的重要结构，其中海马CA1区椎体细胞的易损性在认知损伤的发生中起重要作用[6]。SAMP8中CA1区椎体细胞数量明显减少[7]，突触超微结构受损[8]。突触是神经元间信息传递的连接点，传递脑中的化学信号或电信号，对于学习记忆至关重要。研究发现，认知功能障碍的早期表现主要包括突触的丢失和突触功能的异常[9]。       SYP是一种与突触功能和结构密切相关的突触囊泡蛋白，参与了突触囊泡的导入及转运、神经递质的释放和突触囊泡的再循环过程，是突触发生和重塑的重要标志，可通过了解SYP的定位和定量来反映突触的分布及功能状况。在神经遭受损伤后功能逐渐恢复的过程中，SYP的表达量在一定程度上可较好地反映突触再生和重塑的能力。AD 病人认知功能下降程度与海马及相关皮层SYP的改变有很好的相关性[10]。基因芯片研究表明轻度认知障碍和AD患者海马CA1区突触基因（21/28）明显降低（其中包括SYP），而轻度认知障碍和AD中转录水平无明显差异[11]。Callahan等发现SYP蛋白的丢失量与神经元的神经原纤维缠结成正相关[12]。许丹等[13]发现突触素表达量随增龄而减低，且AD患者CA3区的表达量低于同龄人。Masliah 等[14]报道SYP免疫反应性在MCI 或轻度AD 病人的皮层下降25%，其在中度、重度病人的皮层进一步下降。柴继侠等[15]利用Western blot法检测APP/PS1转基因小鼠海马内drebrin和SYP蛋白表达，发现SYP在AD后期起作用。       SAMP8是研究AD的较为理想的动物模型，自发快速老化和生存期变短，具有AD典型的病理改变，与SAMR1相比，早在4月龄时就发生认知功能损伤，5月龄时其皮层神经元存在减少和TAU蛋白的过度磷酸化，6月龄时其海马树突棘开始减少和Aβ沉积明显增加，8月龄时其海马CA1区椎体细胞的数量明显降低[16]。我们选择的8月龄SAMP8相当于中、重度AD患者，采用免疫组织化学检测了SYP在海马区域的分布和含量。发现SYP主要位于海马 CA1 区的神经毡区，对SYP的基因和蛋白表达研究表明快速老化小鼠SAMP8海马CA1区SYP的表达量明显降低，同上述结果相似。       针刺作为祖国传统医学的重要组成部分，在治疗神经系统疾病中发挥了重大作用，且具备很好的安全性。对于突触可塑性方面的研究，已经发现针刺可以促进SAMP8突触超微结构和受体的改变[17]。针刺加康复可以增加局灶性脑缺血/再灌注损伤大鼠海马CA 3区SYP的表达，促进中枢神经系统的重塑[18]。针刺可提高SYP的表达和促进脑瘫鼠的运动功能恢复[19]。“三焦”针法是韩景献教授基于“三焦气化失司导致痴呆”的病机理论所设，注重调节三焦所涵盖的脏腑功能，充分体现了中医的整体观[20]。过去研究表明该针法可增加多种神经生长因子的水平改善脑内微环境[21]。本研究发现该针法可增加SAMP8海马CA1区SYP的基因和蛋白表达，从而改善椎体神经的形态。      本研究为针刺治疗AD提供了理论和实验依据，同时为AD的治疗提供了一种选择。参考文献[1]Marcello E, Epis R, Saraceno C, et al. 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